免疫荧光

滤光片 激发光 荧光素 B 蓝光 FITC 高强度光源 （相同） G 绿光 罗丹明 UV 紫外光 DAPI
荧光 绿色荧光 红色荧光 蓝色荧光
异硫氰酸荧光素（FITC）
呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定， 在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶 于水和酒精。最大吸收光谱为490～495nm，最大发射 光谱为520～530nm，呈现黄绿色荧光。
8、滴加1：150的羊抗小鼠IgG-FITC染色，室温避光45分钟。 9、Hank’s液洗涤三次，每次3分钟，甩干，50％甘油缓冲液 封片，镜检。
注意事项 1、应同时设相同的Ig同类或亚类的荧光直标无关抗体作为 阴性对照，以保证检测的可靠性。
2、样品制备好后如不能立即观察，需置于4℃冰箱避光保 存。
免疫荧光染色及其应用
Immunofluorescence Staining and its Application
免疫荧光技术
免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)
始创于40年代初，1942年Coons等多次报道用异硫氰
酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶性 肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的 性能较差，未能推广使用。 直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为 优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等(1958)对荧光抗 体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐 渐推广应用。
在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与 免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键， 成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个Ig分子上最多能标记15～20个FITC分子。
直接法： 滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后 在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧
光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。
荧光素
是-种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。 目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。
紫外光激发荧光物质放射荧光示意图


荧光素或荧光染料
每一种荧光素有特定的激发光（吸收），发射 出固定波长的荧光，荧光有红，橙，黄，绿， 青，蓝，紫；但常用的有绿，红和蓝。
一、材料： 1、大肠杆菌：12亿／ml 雄性 3、羊抗小鼠IgG-FITC 5、0.3％戊二醛多聚甲醛
2、小白鼠：18～20克 4、Hank’s液 6、50％甘油缓冲液
二、步骤：
1、腹腔注射大肠杆菌免疫小白鼠，每只0.5ml。并设阴性对照 （腹腔注射生理盐水） 2、免疫后第六天，实验组及对照组小鼠各取一只，颈椎脱臼 处死，打开腹腔，取出脾脏，去除周围的结缔组织，放入含 有8 ml Hank’s液的平皿内。
FITC-细胞桨；DAPI-细胞核
SYBR Green I 溶液染色： 病毒（小点）、细菌（大亮 点）、硅藻（细长的细胞） SYBR Green I 凝胶染色
染色体原位杂交检测
免疫荧光染色，多色叠加
实验内容
小鼠B细胞膜表面Ig（mIgG）测定——直接免疫荧光染色法
细胞膜或细胞内的抗原分子与相应的荧光素直 接标记的mAb结合后，形成带有荧光色素的抗原抗 体复合物。 经激发光激发后发出与荧光素相对应的特定波 长的荧光，其荧光强度与被测抗原分子表达密度成 正比例关系，由此可检测细胞与标记抗体对应抗原 的表达量和阳性细胞百分比。 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，根据 所测定的荧光强度和阳性细胞百分率即可知相应抗 原的密度和分布的比例。
此法的优点是简单、特异。 但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光 抗体，且敏感性低于间接法。
间接法： 此法的优点是敏感性高于直接法，而且无 需制备多种荧光素标记的抗体，就可用于检测同种动 物的多种抗原抗体系统。间接法有时易产生非特异性 荧光，为其缺点。
Actin免疫荧光染色（cy3标记）
3、用眼科剪将脾脏一端剪一小口后，将含5ml Hank’s液的注射器 从另一端刺入脾脏，缓缓注入Hank’s液，即可见脾细胞流入平皿， 在注射Hank’s液同时不断转动针头方向，直至脾脏变苍白为止。
4、将脾细胞悬液吸入试管，静置10分钟，以去除较大块未冲散 的脾组织块，然后将沉淀以上部分移入干净试管。
5、离心（1500rpm 10分钟）并用Hank’s液洗涤一次。细胞计数， 调细胞数为1×107 个/ml。
6、先用记号笔在玻片上画出涂片范围，然后吸取细胞悬液 均匀涂片，每片15微升，电吹风冷风吹干。
7、在涂片的位置滴加0.3％戊二醛多聚甲醛，覆盖固定，15 分钟后倒去，另加戊二醛多聚甲醛再固定10分钟后。Hank’s 液洗涤三次，每次3分钟。
荧光
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指一个分子或原子吸收了外界给予的能量后， 即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停 止。
受到短波激发光照射，发射出波长较长的荧光。 若激发光停止照射，荧光立即熄灭。 荧光的衰减：取决于激发光强度和照射时间。

荧光发生机理
量子理论：光波短，光子能量强；光波长，光子能量小 某些物质接收紫外线和较短波照射------能量增高，处于 不稳定状态-----以光的形式向外释放多余的能量。