荧光免疫分析

酶放大镧系发光分析
TBP系统 双标记、多标记TRFIA
TBP-Eu3+和APC配对
Eu3+和W1174配对
时间分辨荧光免疫分析仪
计 算 机
控 制 模 块
光电传感器
驱动电路 氙灯电源
检测 电源 电控系统
步进电机
氙灯
运动平台
金属离子配合物。 应用较多的是发光半 导体量子点和荧光复 合型纳米颗粒。
信号放 大技术
聚合酶链式 酶联放大技 脂质体包裹 多重标记技 反应放大技 技术 术 术 术 脂质体包埋荧光免疫分析示意图
分析检 测技术
时间分辨荧 光免疫分析
相分辨荧光 免疫分析
同步-导数 荧光免疫分 析
荧光偏振免 疫分析
免疫亲和色谱 度免反该分体反免以素智 。 疫应方离分应疫利敏能 分的法荧离的反用感高 免疫亲和萃取技 色谱免疫技术 析快兼光，标应其的分 术 法速具免从记复相特子 的 性 均高效毛细管电泳 疫而抗合变性对 流动注射免疫分 高和相分 建原物分使环 析 荧光免疫分析 与高效分离 灵异免析立或与离得境 技术结合敏 相 疫 法 相 抗 未 将 可 因 磁性分离 。 “智能高分子” 相变分离
实现分析的技术类型
• • • • • 夹心法 竞争法 间接法 捕获法 应用亲和素和生物素的TRFIA
检测时可以直接测量 结合物的荧光强度， 无需加入增强液，主 要用于固相时间分辨 系统。
稀土离子的标记
多氨基多羧酸类螯合物 芳香羧酸类螯合物
稳定性较强，溶解度较高， 螯合能力强，标记物的比活 性较高，但是传递激发光的 能力弱。，
种类 荧光寿命（ns） 1~10TRFIA的主 非特异背景荧光 • 镧系元素属于稀土元素，常用于 激发光波长 发射光波长 Stokes 位移 4.1 Tb 稀土离子螯 人血清血蛋白 要有铕（ Eu ）、钐（Sm ）、铽（ ）、镝 合物 （ Dy ），具有独特的荧光发光特点： 3.0 人球蛋白、血红蛋白 Eu-( β -NTA) 340 613 273 3 3.5 细胞色素 C ① 镧系离子螯合物荧光衰变时间长； Sm-( β-NTA)3 340 600 4.5 260 异硫氰酸荧光素 FITC ② 激发光与发射光之间的Stokes位移较大； Tb-(PTA) 295 490/543 195/248 3 14 丹磺酰氯 ③ Dy-(PTA) 被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非 295 573 16 278 3 苯胺萘磺酸 常尖锐。 104~106 稀土螯合物
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荧光免疫分析法的发展趋势
（1）高特异性、高亲和性抗原和抗体的制备。
（2）荧光标记物进一步更新和相应的荧光检测技术 的提高。
（3）与高效分离技术相结合。
（4）实际应用中的在线和现场荧光免疫分析。 （5）免疫芯片的实用化以实现微量多组分的免疫分析。
时间分辨荧光免疫分析
• TRFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离 子及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、 激素、多肽、蛋白质、核酸探针和生物细 胞，待反应体系（如抗原抗体反应、核酸 探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞 对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用 TRFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。 根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值， 判断反应体系中分析物的浓度，从而达到 时间分辨荧光测定原理示意图 定量分析。
常 用 稀 土 离 子 螯 合 剂
β-二酮体类螯合物
特殊功能的螯合物
增强液中的主要 成分，但螯合物 不够稳定，只能 用于检测不能用 于标记。
主要有W1174和 W2014两种，是 异硫氰酸盐类似 物。
主要分析系统
时间分辨固相荧光免疫分析
非均相时间分辨荧光 免疫分析 均相时间分辨免疫分 析技术
解离增强镧系荧光免疫分析
纳米荧光标记物
有机荧光染料
藻胆蛋白是一类具 有优良性质的荧光 标记物，绿色荧光 蛋白是紫外-可见区 另一种具有潜力的 标记物。
荧光素类标记物 由于酶分子的催化放 较，其光丹 大作用，酶标记物在 的荧光量子产率 小 样发产明 FIA 中占据重要地位。 高，有较好的光
扰长但荧罗
。品射率类 目前研究较多的无机 稳定性和低的温 背波较标 荧光配合物以铕和铽 度系数，但其荧 景长小记 居多，另一类是在近 干较，物 光对散射光敏感。 红外区发射荧光的贵
荧光免疫分析法
报告大纲 一、引言 二、基本模式 三、标记物 四、信号放大技术 五、分析检测技术 六、与高效分离技术的结合 七、发展趋势 八、时间分辨荧光免疫分析技术
化学发光是在特定化 学反应中产生的光辐射， 化学发光免疫分析法CLIA 酶免疫分析法EIA是一种有效 是化学发光与免疫测定结 的非放射性免疫分析方法， 放射性免疫分析法 荧光免疫分析法 FIA 与EIA、CLIA法相比，具有 合起来的一种高效检测手 它以酶为标记物，结合酶的 灵敏度高、可测参数多、动态范围宽、标记物 段，灵敏度高，不需激发 高效放大作用和显色检测的 • 免疫分析是基于蛋白抗原和抗体之间、或 稳定且可实现均相免疫分析等优点，特别是 光源，仪器简单，但是可 简便性，从而得到了广泛应 者小分子半抗原和抗体之间的特异反应的 TRFIA 的发展，极大提高了 FIA的检测灵敏度。 以利用的化学发光反应相 用。但亦存在着酶稳定性差， 分析方法，是生物分析化学的重要内容之 目前已成为一种成熟有效的非放射性免疫分析 对有限。光 对抑制和变性因素敏感等问 一。 法得到广泛应用，是免疫分析研究中最为活跃 题。 的领域。 非放射性免疫分析
竞争型
基本模式
夹心型
常用为荧光素类及 罗丹明类染料
标 记 物
荧光纳米颗粒的出现对生物 大分子的检测方法产生了重 蛋白质荧光标记物 要的影响，不仅提升了现有 分析方法的灵敏度，还提供 酶标记物 了无可比拟的标记灵活性， 结合信号放大技术，可进一 步提高分析灵敏度，其在荧 金属配合物标记物 光免疫分析中无疑具有旺盛 的生命力。