荧光免疫技术
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
荧光免疫技术
二、标记抗体的纯化
目的 去除未结合的游离荧光素
去除过度标记的蛋白 去除非特异反应抗体
方法
透析法 将标记物置于透析袋中透析；适 用于蛋白含量低的标记物 凝胶过滤法
常用Sephadex G50凝胶，洗脱第 一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素 峰。
离子交换层析法 依次洗脱下来的成分是未结合荧 光素的抗体、荧光标记合适的抗体、
亮黄绿色 最广泛
桔红色 橙红色 常用于双重标记或 对比染色 衬染或单独染色, 荧光猝灭速度慢 与FITC一起用于 双色免疫荧光染色, 共用488nm波长
藻红色
其他荧光物质
镧系螯合物 如 Eu3+ 等
酶作用后产生荧光的物质
如: 4甲基伞酮-β-D半乳糖苷
β-半乳糖苷酶 4甲基伞酮
荧光免疫分析常用的仪器和设备
荧光偏振
P=
FH-FL FH+FL
P=0说明完全不偏振，-1<P<1为部分偏振
荧光物质
最大吸收 最大发射 波长(nm) 波长(nm) 异硫氰酸荧 490~495 520~530 光素(FITC) 570 595~600 四乙基罗丹 明(RB200) 550 620 四甲基异硫 氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白 (R-RE) 565 578 名 称 荧光颜色 应 用
试剂
95% 乙醇、甲醇、丙酮、 10% 福 尔马林等。
二、荧光抗体染色
目的： 使荧光抗体与待观察的抗原
结合，达到示踪效果。
步骤：于已固定的标本上滴加经适
当稀释的荧光抗体，25~37℃湿盒 反应30分钟，用PBS洗涤，缓冲甘 油封片。
直接法
荧光标记抗体 抗原
间接法
荧光标记抗体 特异抗体 抗原
08第八章 荧光免疫技术
第八章
荧光免疫技术
一、CLSM的工作原理
激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦 平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探 测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管逐点 或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧 光图像。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
二、CLSM的参数
仪器的参数有：①物镜；②激光功率； ③激光扫描程度；④探测针孔；⑤光电倍增
换层析法;
(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固
相抗原吸收。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
5. 荧光素标记抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特
异性、抗体抗体特异性染色滴度。
6. 荧光记抗体的保存
加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免
反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥 后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。
以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、细胞免疫
芯片。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
1.液体芯片 一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。
将微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法
进行编码，每种颜色的微粒代表一种检测标志物， 把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后加入微 量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性 地结合，通过激光流式仪判定后由电脑以数据信 息的形式记录下来。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
FITC的衬比染色或双标记FAT， 也可单独采用 可与FITC共用488nm激发光双标 记FAT、流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 DNA染色 双激光管的仪器分析 时间分辨荧光免疫测定
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介1、荧光免疫测定技术的概念将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2、技术分类（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
3、荧光的产生物质吸收外界能量而进入激发状态，在恢复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素。
由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术。
4、荧光素的荧光特性（1）停止供能，荧光现象随即终止。
（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性。
入射光波长<发射光波长。
（3）荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=---------------------------吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱。
5、常见荧光素及其特性（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光490~495nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
（3）TRITC：紫红色粉末，吸收光550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
（4）镧系：Eu3+、Tb3+等。
（5）PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
（6）其它：酶作用后产生荧光物质，具体如下表：酶底物产物激发光发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 4146、合适荧光素的选择（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖ ���颉���S H H S H（2）荧光效率高，标记后下降不明显。
临床免疫学检验 课件 第8章 荧光免疫技术
3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：1、细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.3、通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
免疫荧光技术
免疫荧光技术荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。
这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。
与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。
国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
有关荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。
由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。
荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。
荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。
各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学和生命科学领域中的分析技术。
根据不同的用途和操作方法，免疫荧光技术可以分为以下几类：
1. 直接免疫荧光法
直接免疫荧光法是一种最简单的免疫荧光技术，通常用于检测单一抗原。
该方法将荧光标记的抗体直接与待检测物接触，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
2. 间接免疫荧光法
间接免疫荧光法是一种常用的免疫荧光技术，可用于检测多个抗原或抗体。
该方法通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，然后使用荧光标记的二级抗体识别和结合一级抗体，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
3. 间接免疫荧光染色法
间接免疫荧光染色法是一种特定的间接免疫荧光技术，通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，再使用被标记的一级抗体结合一级抗体，形成免疫复合物。
该方法可以用于检测多个抗原或抗体，并且适用于细胞和组织的检测。
4. 光度法免疫荧光
光度法免疫荧光是一种快速、准确的免疫荧光技术，用于检测微量物质，如细菌和病毒。
该方法通过对待测样品进行化学反应，形成荧光物质，然后测量荧光信号强度。
5. 免疫电子显微镜法
免疫电子显微镜法是一种高分辨率的免疫荧光技术，用于检测细胞和分子水平上的抗原或抗体。
该方法使用标记有金颗粒的抗体，进行免疫染色，然后使用电子显微镜观察荧光信号。
总之，免疫荧光技术是一种多功能的生物分析技术，可用于各种生命科学领域，其中不同的分类方法可以根据需要进行选择。
临床免疫学检验-荧光免疫技术
标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品)
标记抗体的纯化：透析法、凝胶过滤法
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：凝胶过滤法
2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义
争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光 标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。 由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离 的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所 产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中 测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反 比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关 系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。
BG：325-500
OG：410-650
(exciting the fluorochrome) ↓
each droplet (cell) emits the fluorescence
(small electrical change)
10. Flow cytometry & Fluorescence
• Fluorochromes have the ability to absorb energy from light an emit it at a longer wavelength.
• 某些物质能够从外部接受能量而进入激 发态,当其从激发态回复至基态时,过剩 的能量以电磁波的形式发射称为发光(荧 光).
ห้องสมุดไป่ตู้
• 时间分辨 • Stokes位移（激发光谱和发射光谱的波长
差）
• 较窄的发射光谱（613nm +- 10nm)
免疫荧光技术
免疫荧光技术在肿瘤治疗中的应用：通过检测肿瘤细胞表面的抗原，帮助医生制定个性化的治疗方 案
免疫荧光技术在传染病治疗中的应用：通过检测病原体表面的抗原，帮助医生制定针对性的治疗方 案
免疫荧光技术的 优缺点
优点
灵敏度高：能够检测到低浓度 的抗原或抗体
行标记
荧光信号的检测和成像
荧光信号的产生：通过荧光染料标记抗体或抗原，与靶标结合后产生荧 光信号
荧光信号的检测：使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行检测和定量分析
荧光信号的成像：通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行成像和分析，获得细胞或组织中靶标的分布和表达情况
荧光信号的定量分析：通过对荧光信号的检测和成像，对靶标进行定量 分析和评估，为科学研究和临床诊断提供依据。
蛋白质相互作用研究
免疫荧光技术 可以检测蛋白 质之间的相互
作用
免疫荧光技术 可以定量分析 蛋白质相互作 用的强度和动
力学
免疫荧光技术 可以研究蛋白 质相互作用的
机制和功能
免疫荧光技术 可以应用于药 物筛选和疾病
诊断
疾病诊断和治疗
免疫荧光技术在疾病诊断中的应用：通过检测细胞表面的抗原，帮助医生快速准确地诊断疾病
免疫荧光技术的 发展趋势和未来 展望
发展趋势
自动化：免பைடு நூலகம்荧光 技术将更加自动化， 提高检测效率和准 确性
多重检测：免疫荧 光技术将实现多重 检测，提高检测的 灵敏度和特异性
便携式：免疫荧光 技术将更加便携式 ，方便现场检测和 快速诊断
智能化：免疫荧光 技术将更加智能化 ，实现自动分析和 诊断
荧光免疫技术名词解释(一)
荧光免疫技术名词解释(一)荧光免疫技术及其相关名词1. 什么是荧光免疫技术？荧光免疫技术（Fluorescent Immunoassay）是一种利用荧光探针标记特定分子或抗体，以荧光信号来检测目标分子或抗体的存在和相对浓度的方法。
2. 荧光免疫技术的相关名词•抗原（Antigen）：指能诱导机体产生特异性抗体的物质，常常是指病原微生物、异常细胞或其代谢产物。
–例：新冠病毒的核蛋白抗原（N蛋白）•抗体（Antibody）：由机体内特异性B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，能与抗原结合并识别、中和或清除其对机体的危害。
–例：特定兔源抗新冠病毒抗体•荧光探针（Fluorescent Probe）：具有发射特定波长荧光的化学物质，通过与目标分子或抗体结合形成复合物，用来标记或检测目标分子或抗体。
–例：Rhodamine B荧光探针•荧光标记（Fluorescent Labeling）：将荧光探针与目标分子或抗体结合，使其发射荧光信号，以便于检测。
–例：将特定抗体与荧光探针标记•荧光显微镜（Fluorescence Microscope）：一种利用荧光免疫技术可以观察和拍摄荧光信号的显微镜。
–例：利用荧光显微镜观察细胞标记的荧光信号•免疫荧光染色（Immunofluorescence Staining）：将样本中的目标分子或抗体与荧光探针结合，使其发射荧光，并利用荧光显微镜观察荧光信号强度和分布。
–例：利用免疫荧光染色技术检测肿瘤标志物的表达情况•流式细胞术（Flow Cytometry）：结合荧光免疫技术的一种高通量细胞分析技术，能够对单个细胞进行快速检测、分析和排序。
–例：利用流式细胞术检测淋巴细胞表面标记物的表达•生物荧光成像（Bioluminescence Imaging）：利用生物体内产生的荧光信号进行分子或细胞水平的活体成像。
–例：通过生物荧光成像技术观察小鼠体内肿瘤的生长情况•多肽荧光标记（Peptide Fluorescent Labeling）：利用荧光探针将特定的多肽序列标记，用于检测多肽结构和相互作用。
荧光免疫技术在医学检验中的应用
荧光免疫技术在医学检验中的应用
一、荧光抗体技术的应用
1.自身抗体检测荧光抗体技术可用于检测血清抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体，辅助诊断自身免疫性疾病。
2.病原体检测荧光抗体技术可快速鉴定病原体并可检测血清中抗体，用于疾病诊断、流行病学调查和临床回顾诊断。
3.免疫病理检测荧光抗体技术可用于组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测及肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定。
4.细胞表面抗原和受体检测荧光抗体技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、FC受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。
荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析。
在这种分析法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射后发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。
二、荧光免疫测定的应用
目前.，时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定都有全自动化测试的分析仪器，这些仪器具有试剂和样本条码识别系统，能自动加样、温育、洗涤、分离、测定荧光强度、处理数据和报告结果。
时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等；荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定，目前己有数十种治疗药物和成瘾药物、维生素、激素及常规生化项目可用荧光偏振免疫测定进行分析和定量测定；荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子等。
免疫--荧光免疫技术 图文版
荧光素要求
有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易 解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
荧光偏振
当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期（对于荧光素约持续 4纳秒）保 持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平 面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。 如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直 的和水平的偏振平面检测发射光光强（发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标 记的分子的迁移率有关）。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高 如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
4.5
Tb3+-PTA
14
Dy3+-PTA
3.0
荧光寿命(ns) 65000 60000 714000 925000 96000 1000
时间分辨荧光免疫测定 标记方法
双功能螯合剂 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样 品发射荧光的强度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光免疫试验
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570～ 四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素 氨基Eu3+螯合物 550nm 490490-560nm 354nm 340nm
第二节 荧光抗体技术
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应， 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗 涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 或对自身抗体进行定性和滴度测定。 或对自身抗体进行定性和滴度测定。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 标记原理: 利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 FITC 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 FITC结合成荧光抗体 标记方法: 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 荧光素用量少，但有非特异性染色。 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。 非特异染色较低。
二、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 荧光物质
常用的荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 最大吸收光谱 490～495nm 490～ 最大发射光谱 应用 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定 黄绿色） FAT、 520～ 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT 620nm（橙红色） 620nm（橙红色） 595nm（红色） 595nm（红色） 430nm（蓝色） 430nm（蓝色） 613nm FITC的衬比染色或双标 FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、 双标记FAT、流式细胞术 FAT 双标记或多标记FAT 双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照: 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 - ：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 ：荧光较弱但清楚可见。 ++”：荧光明亮。 “++ ：荧光明亮。 +++”：耀眼强荧光。 “+++ ：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 特异荧光强度“++ 以上判定为阳性，对照光应呈“ 或 。 以上判定为阳性 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 "++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
荧光抗体的制备
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除游离荧光素及其降解产物： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体： 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备长，在不同波长下记录的样 发射光谱是指固定激发波长， 是指固定激发波长 品发射荧光的强度。 品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长， 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 是指固定检测发射波长 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
滤光片
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间， 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 保护眼睛。 保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光： 透射光：照明光线从标 本下经聚光器透过标本 进入物镜。 进入物镜。 落射光： 落射光：照明光线从标 本上经垂直照明器落射 到标本， 到标本，经标本反射进 入物镜。 入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b) 落射荧光显微镜光路(b)
stokes位移: stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 位移 镧系元素Stokes位移大(273nm) Stokes位移大(273nm)， 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm， 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm， 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
荧光标记物的相对比活性
比活性： 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000 /S激发 1000次 激发， 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
信号增强
Eu3+标记抗原 抗体复合物
酸性增强液
Eu3+解离
结合β 结合β-二酮体
-20℃：保存1～2年 20℃：保存1 真空干燥： 真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片： 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞： 培养细胞：单层培养细胞
荧光的基本知识
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下， 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、 20℃）、苯胺、 ）、苯胺 酚、硝基苯、I-等 。 硝基苯、
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝────── ＝ FH＋FL
第八章 荧光免疫技术
第一节 概述 一、荧光的基本知识 二、荧光物质
第二节 荧光抗体技术 一、标本的制作 二、荧光抗体的制备 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用 思考题 小结
标本的制作
组织切片的类型
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。
标本的制作
标本的固定和保存 标本的固定和保存
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、 保 4℃、 存：4℃、-20℃
一、时间分辨荧光免疫测定
基本原理
时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～ 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～ 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
stokes位移 stokes位移
四、荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光对 样品进行激发， 样品进行激发，产生一定波长 的荧光， 的荧光，对样品结构或其组分 进行定性、定位、 进行定性、定位、定量观察检 测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 光源：高压汞灯、 滤光片：隔热、 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 光路：透射光、 聚光器：明视野、 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头： 镜头：消色差镜头
荧光素与蛋白结合率： 荧光素与蛋白结合率： F/P=
2.87 × A495nm A280 nm 0.35 × A495nm
抗体效价： 抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度： 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence） 荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后， 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时， 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。 放出能量，称为荧光。
荧光的基本知识
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定