免疫荧光
免疫荧光介绍
免疫荧光介绍免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位.它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体)。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理及特点：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色）,可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快.主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种.与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便,便于推广。
国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。
新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等.细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单,如果发生细胞掉片，一切都无从谈起.这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门,非常值得借鉴。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
免疫荧光层析法 化学发光
免疫荧光层析法化学发光免疫荧光层析法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）和化学发光（Chemiluminescence）是两种常用的检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
本文将介绍这两种技术的原理、步骤和应用，以及它们之间的区别和优缺点。
免疫荧光层析法是一种利用抗体与特定抗原结合后可发出荧光信号的检测方法。
它的原理是将标记有荧光染料（如荧光素）的抗体与待检样品中的目标抗原结合，形成免疫复合物。
通过荧光显微镜观察，可以检测到目标抗原的存在与否。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和无需放射性标记物的优点，被广泛应用于病原微生物的检测、抗体的定量和细胞蛋白的定位等研究领域。
化学发光是一种利用化学反应产生的光信号来检测目标物质的方法。
它的原理是将待检样品中的目标物与标记有化学发光底物的抗体结合，形成免疫复合物。
当加入特定的激发剂后，底物会发生化学反应，产生可见的光信号。
通过光电倍增管或摄像机的检测，可以定量地测量化学发光强度，从而判断目标物的含量。
化学发光方法具有高灵敏度、宽线性范围和较低的背景信号等优点，因此在临床诊断和生物工程领域得到广泛应用。
免疫荧光层析法和化学发光在实验步骤上存在一些差异。
免疫荧光层析法的步骤包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和显微镜观察等。
而化学发光的步骤则包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和化学反应等。
两种方法的原理都是基于抗体与抗原的特异性结合，但在标记物和检测信号的产生上有所不同。
免疫荧光层析法和化学发光在应用上也存在一些差异。
免疫荧光层析法常用于检测细胞表面标记物、病原微生物和抗体等，广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
而化学发光常用于检测肿瘤标志物、药物残留和基因表达等，被广泛应用于药物研发和生物工程领域。
两种方法在不同领域有着各自的优势和适用范围。
总的来说，免疫荧光层析法和化学发光是两种常用的生物分析技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛应用的特点。
免疫荧光染色实验用途
免疫荧光染色实验用途
免疫荧光染色实验是一种常用于生物学研究中的技术手段。
该实验通过特定的抗体与样品中的特定分子结合，利用荧光标记物检测目标分子的分布、定位和相互关系等信息。
其主要用途包括：
1. 诊断疾病：免疫荧光染色可以用于检测许多疾病相关的分子，如癌细胞、病原菌、病毒等。
这种方法对于早期诊断和治疗疾病具有很大的帮助。
2. 研究细胞结构和功能：免疫荧光染色可以帮助科学家研究细
胞内各种结构和分子的功能和相互作用。
它可以用于寻找细胞功能的关键分子、了解细胞内化学反应和信号传递的机制等。
3. 分析蛋白质表达：免疫荧光染色可以用于确定样品中特定蛋
白质的表达水平。
这种方法可以帮助科学家了解蛋白质在细胞中的定位、丰度和功能等。
4. 研究生物学过程：免疫荧光染色可以用于研究许多生物学过程，如细胞周期、细胞凋亡、分化、生长和分裂等。
通过检测关键分子的分布和定位，科学家可以了解这些生物学过程的机制。
总之，免疫荧光染色实验是一种非常有用的技术手段，可以应用于各种生物学研究中。
它可以帮助科学家深入了解生物学过程的机制，同时也可以为疾病的诊断和治疗提供重要的帮助。
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免疫荧光结果解读
免疫荧光是一种常用的检测方法，用于检测和定位蛋白质、抗体和其他生物分子。
在免疫荧光结果解读中，需要了解以下几个方面：
1. 阳性和阴性结果：免疫荧光结果通常分为阳性和阴性两种。
阳性表示样本中存在目标分子，而阴性则表示不存在。
2. 荧光强度：荧光强度是指样本中荧光信号的强度。
荧光强度高表示目标分子数量多，荧光强度低则表示目标分子数量少。
3. 染色模式：染色模式是指样本中荧光信号的分布方式。
常见的染色模式有均匀染色、斑点状染色、线状染色等。
4. 背景噪声：背景噪声是指非特异性结合或其他因素引起的荧光信号。
高背景噪声会影响结果的准确性。
5. 比较分析：免疫荧光结果需要与正常对照组进行比较分析，以确定是否存在异常情况。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光 标准方法
免疫荧光标准方法一、样品制备1. 选取适当的组织样品，用冷丙酮固定，并保存在-80°C。
2. 将样品切成5μm厚的切片，放置在载玻片上。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用3%的H2O2在室温下处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用0.1%的Triton X-100在室温下处理切片10分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
二、免疫荧光染色1. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭切片，室温下放置30分钟。
2. 取出切片，用特异性一抗溶液封闭切片，4°C孵育过夜。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用荧光二抗溶液封闭切片，室温下孵育1小时。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用DAPI染色液染色核，室温下孵育5分钟。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
8. 用抗荧光淬灭封片液封片，避免强光照射。
三、观察和记录1. 用荧光显微镜观察切片，记录荧光信号的位置、强度和分布情况。
2. 对每个样本至少观察三个不同的视野，并记录数据。
四、结果分析1. 根据荧光信号的位置、强度和分布情况进行分析。
2. 可使用图像分析软件进行定量分析。
3. 根据分析结果进行数据处理和统计。
五、标准化1. 采用阳性对照和阴性对照作为内标。
2. 阳性对照应呈现强烈的荧光信号，阴性对照应无荧光信号。
3. 对所有样本进行标准化处理，以保证结果的可靠性。
六、质量控制1. 实验过程中应避免交叉污染和样品间的干扰。
2. 对实验数据进行及时记录和分析，确保数据的准确性和完整性。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
免疫荧光染色名词解释
免疫荧光染色诊断是利用免疫荧光染色及显微镜做病理的一种诊断手法，通常用于检查免疫性疾病患者的各类标本。
免疫荧光染色又叫做FISH，主要是通过荧光标记抗原抗体，观察抗原抗体反应的高度特异性来做疾病的诊断。
比如乳腺癌组织中人表皮生长因子受体-2免疫组化染色显示2+，那么就必须做免疫荧光染色。
免疫荧光染色诊断可以分为直接免疫荧光染色诊断和间接免疫荧光染色诊断。
1、直接免疫荧光染色诊断：所用的染色方法为直接染色法，直接染色法常使用被标记的特异荧光抗体，使之与抗原反应一段时间后，洗去未参加反应的抗体后在显微镜下观察，根据阴阳标本对照得出诊断结果；
2、间接免疫荧光染色诊断：所用的染色方法为间接染色法和抗补体染色法。
间接染色法常用已标记和未标记的抗体分别与抗原反应，将形成的两种复合物再次结合形成新的复合物，洗去多余抗体后在显微镜下观察得出诊断。
免疫荧光染色诊断，应根据疾病的需要采取相应的检测方法。
免疫荧光间接法注意事项
免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。
通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。
免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。
在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。
通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。
【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。
免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。
这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。
在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。
需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。
这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。
免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。
只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。
所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
免疫荧光补体法
免疫荧光补体法免疫荧光补体法是一种常用的实验技术，用于检测体内特定抗原和抗体之间的相互作用。
该方法基于抗原与抗体结合后形成的免疫复合物能够与补体相互作用，从而产生可观察的荧光信号。
本文将介绍免疫荧光补体法的原理、操作步骤以及应用领域。
免疫荧光补体法的原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在免疫反应中，抗原与抗体结合后形成免疫复合物。
为了观察和检测这些免疫复合物，研究者通常会将抗体或抗原标记上荧光染料。
当标记有荧光染料的抗体与抗原结合后，形成的免疫复合物可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
然而，为了增强检测的灵敏度和准确性，免疫荧光补体法还需要将补体引入实验中。
免疫荧光补体法的操作步骤如下：1. 样本制备：从实验对象中收集所需的组织或细胞样本，并将其固定在载玻片上。
固定方法通常包括冷冻、乙醛或乙酸等。
2. 抗原或抗体标记：将所需的抗原或抗体标记上荧光染料。
这一步骤可以使用特定的标记试剂盒，根据试剂盒提供的操作步骤进行标记。
3. 标本处理：将标记有荧光染料的抗原或抗体加入到固定的样本上，使其与目标分子结合。
4. 洗涤：用缓冲液洗涤样本，去除未结合的抗原或抗体。
5. 补体反应：加入补体试剂，使其与样本中的免疫复合物相互作用。
补体与免疫复合物结合后，会触发一系列的补体反应，产生可观察的荧光信号。
6. 观察和分析：将样本置于荧光显微镜下观察，并通过图像分析软件进行图像处理和荧光信号的定量分析。
免疫荧光补体法在生物医学研究中有着广泛的应用。
它可以用于检测和定位特定抗原或抗体在组织或细胞中的分布情况。
例如，在免疫组织化学中，免疫荧光补体法可以用来鉴定和定位特定的蛋白质或细胞标记物。
此外，免疫荧光补体法还可以用于检测和鉴定自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤等疾病的标志物。
免疫荧光补体法是一种重要的免疫学实验技术，通过标记荧光染料的抗原或抗体与补体的相互作用，可以实现对特定抗原或抗体的定位和检测。
该方法操作简单、结果准确，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
免疫荧光技术
一般常用DAPI复染。
7、封片： 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液； 避免产生气泡。
5、二抗孵育条件：
二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；
而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度； 切记要避光反应；
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间；
四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉 末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与 FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用 于单独标记染色。
【固定液的选择】
2、冰冻切片制备：
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
3、血清封闭： 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致） 封闭，减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低 背景。 血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的
定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间
活细胞动态观察。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光操作流程
免疫荧光操作流程
免疫荧光是一种常用的物理检测技术，它展示了单个细胞内的基因表达活动。
它使用许多不同类型的免疫检测物质，可以同时识别和测量多个桥接的细胞行为。
免疫荧光操作流程如下：
首先，将样本涂在显微镜滑动片上，然后进行细胞和囊泡处理，以消除任何干扰物质。
然后，将识别抗体滴加到被检测的细胞上，并将含有显色剂的抗体滴加到细胞表面，以检测其可能的表达形式。
接着，放入荧光显微镜，以检查免疫抗性是否表达，如果细胞上有抗原，含有抗体的显色剂会呈现出荧光。
最后，在电脑上显示出获得的微图，记录并分析检测结果，以了解细胞表达的情况。
总体而言，免疫荧光是物理检测技术中用于识别和测量细胞行为的有力工具，它可以帮助研究者深入了解细胞表达以及各种分子事件以及细胞内活性。
由于其快速、灵敏和可重复性等特点，它经常被用于病患疾病的诊断，药物开发和基础生物学研究等。
免疫荧光定义
免疫荧光定义《嘿，免疫荧光定义，了解一下呗！》咱今儿来聊聊免疫荧光定义这个听起来有点专业的玩意儿。
其实啊，免疫荧光简单来说，就是一种很牛的生物技术手段啦！想象一下，细胞就像一个小小的微观世界，里面有着各种各样的分子在“奔跑”和“互动”。
而免疫荧光就像是我们给这个微观世界亮起的一盏盏“小灯”，让我们能清楚地看到那些重要的分子在干什么。
它是怎么做到的呢？嘿嘿，这就扯到抗体啦！这些抗体就像小侦探一样，专门去和特定的分子“牵手”。
然后，再给这些抗体带上一些能发光的“小饰品”，哇，这时候，那些特定的分子就变得闪闪发光啦！通过显微镜一看，嘿，一目了然，它们在哪儿，数量多少，都能看得清清楚楚。
这可太有用啦！比如说，医生们可以用这个技术来看看细胞里面有没有什么病变的蛋白，从而诊断疾病。
科研人员们也可以用它来研究细胞的各种活动和机制，就像看一场微观世界的大戏。
我第一次了解免疫荧光的时候，就觉得这简直太神奇啦！就好像进入了一个充满魔法的世界，那些小小的细胞在免疫荧光的照耀下，变得如此清晰和有趣。
记得有一次在实验室里，我和小伙伴们一起做免疫荧光实验，满心期待着看到那些漂亮的荧光图像。
结果呢，一开始因为操作不当，啥都没看到，一片黑乎乎的。
我们几个那叫一个沮丧啊，以为实验失败了。
但是，咱可不能轻易放弃呀，赶紧查资料找原因，重新来过。
最后，当我们终于在显微镜下看到那些闪闪发光的信号时，哎呀呀，那心情，别提有多激动了！免疫荧光定义虽然听起来有点深奥，但实际上，它就像一把打开微观世界大门的钥匙，让我们能更深入地了解生命的奥秘。
所以啊，大家别被它的专业名字吓住啦，其实它很有趣很神奇的哦！不管是医生还是科学家，或者是像我这样对生物学充满好奇的普通人，都能在免疫荧光的世界里发现别样的精彩呢！朋友们，一起去探索这个充满魅力的免疫荧光世界吧！。
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Excitation Filter •Single Band Pass •Dual,Triple,Quad
Brightfield
Brightfield: Condenser + Objective Fluorescence: Objective
F.I.S.H.
L - light source; E - excitation filter; CBS - chromatic beam splitter; B barrier filter; 0 - objective; C - condenser; Oc - ocular; P - preparation.
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应 时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与
FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86
个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S H H FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ H S H
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1 抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。 荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。 结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 SephadexG50或 G25 保存 4℃ ,-40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法
Golden Rules of Fluorescent Microscopy
• Ensure that filters are optimised for fluorochromes used. • Treat filters with great care. • Ensure an adequate, full spectrum, light supply. • If possible use an imaging system.
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部 不能充分激分。
(4)封片剂
常用甘油，必须无自发荧光，
无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封 片剂。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声
学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光 调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共
聚焦系统组成。
(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元 件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化
学基团，结合后不易离解，而未结合的色 素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。 (3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。 (4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。 (6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
呈橙红色荧光。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉 末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光谱570nm，最大
发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧
光，分子量580，RB200不能直接和蛋白
质结合，要先经五氯化磷反应，转化成
硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热 滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 分光镜 U 激发滤光片 截止滤光片 用途 BA420 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 DM400 BP330-385 BP360-370
Emission Filter •Single or Multi Band Pass
Wavelength
Intensity
Wavelength
Intensity
Dichroic Mirror
Intensity Wavelength
Fluorescent Light Source •100W •Mercury
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源 时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，
超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集 中检查，以节省时间，保护光源。光源关
IB G
DM505 PB460-490
BA515IF BA590 罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
BP470-490
DM570 BP510-550 BP530-550 BP480-550
IG
DM565 BP520-550
DM600 BP545-580
BA580IF
BA610IF 德克萨斯红：荧光抗体观察
Sample DNA
Probe DNA
Fluorescent In Situ Hybridization
Denature
Hybridize
Direct Label Wash & Detect
Indirect Label
How does fluorescence microscopy work?
Epi-Fluorescent Detection
记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，
湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
V
BV
DM455 BP400-410
DM455 BP400-440 BP420-440
BA455
BA475
儿茶酚胺观察
芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸
B
DM500 BP450-480
BP470-490 BP420-480
BA515
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察
吖啶橙：DNA，RNA 金胺结核杆菌
免疫荧光组化技术
主要内容
一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法
四、荧光抗体的质量鉴定
五、免疫荧光组化染色方法
六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
思考题：
1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备 方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？
发射
以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以
辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很
不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也 很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的 光能并发射荧光。
2.间接法
是直接法的重要改进，先用标
记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结 合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异
性结合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石 蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS
洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h， 或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 甘油ຫໍສະໝຸດ 蒸馏水 4.8g 12ml 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心， 15min，最后加入1.4-diazobicydo[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度 2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于20℃中。 (5)镜油
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser
scanning confocal microscope,LSCM) 是80年代发展起来的一项具有划时代意 义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层 扫描成像，从而对被检物体样品从停留到 表面单层，静态平面的观察进行到立体， 断层扫描、动态全面的观察，在生命科学 研究中得到迅速应用。
闭后必须在30min后才能再启动光源，一 天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”
为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋ ＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝