免疫荧光技术
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介1、荧光免疫测定技术的概念将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2、技术分类（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
3、荧光的产生物质吸收外界能量而进入激发状态，在恢复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素。
由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术。
4、荧光素的荧光特性（1）停止供能，荧光现象随即终止。
（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性。
入射光波长<发射光波长。
（3）荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=---------------------------吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱。
5、常见荧光素及其特性（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光490~495nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
（3）TRITC：紫红色粉末，吸收光550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
（4）镧系：Eu3+、Tb3+等。
（5）PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
（6）其它：酶作用后产生荧光物质，具体如下表：酶底物产物激发光发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 4146、合适荧光素的选择（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖ ���颉���S H H S H（2）荧光效率高，标记后下降不明显。
免疫荧光技术
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀 后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述 PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀 后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液， 进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 中间洗脱出来的是荧光标记合适的抗体部分。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 但经此法纯化，标记抗体损失达50%。
⑶ 除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织 的组织粉预先吸收。 按每ml标记抗体加100mg组织粉比例混合， 4℃ 磁力搅拌1h，静置1h，1800r/min于4℃条件下离 心20min取上清液，再用每ml标记抗体加组织粉 比例重复一次。
（三）荧光抗体的鉴定
荧光素与蛋白结合率：
P:总蛋白质的量。F：荧光色素量。（物质的量）
*
*
固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜.
F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
F/P=
IgG (mg/ml)
荧光色素（μg/L ） 160 000x10 3 荧光色素 ( μg/L ） x 0.4 x 6
IgG (mg/ml) 390x10
病毒
无水乙醇,丙酮、CCl4
（3）固定后处理
抗原固定后必须立即以冷PH7.4 PBS冲洗,顺序经过三缸 浸泡,每缸3min，末次再以蒸馏水浸泡1min以脱盐。 标本固定干燥后最好立即进行荧光染色及镜检，如必须 保存则应保持干燥，置于4℃以下保存，一般细菌涂片或 组织切片经过固定后可保存一个月以上，但病毒和某些 组织 抗原标本则需-20℃以下保存。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
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将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：1、细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.3、通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术基本原理
免疫荧光技术是一种利用免疫反应原理进行检测的方法，通过标记荧光物质来检测目标物质的存在。
免疫荧光技术的基本原理如下：
1. 免疫反应：在免疫体系中，由于抗原与抗体之间存在特异性结合作用，可以通过免疫反应的方式将需要检测的目标物质与抗体结合起来。
2. 标记：将荧光物质与抗体结合，形成荧光标记的抗体。
常见的荧光物质有荧光素、荧光染料等，可以通过共价结合或非共价结合的方式将荧光物质与抗体结合。
3. 检测：将荧光标记的抗体加入样品中，使其与目标物质结合。
通过荧光显微镜或荧光分析仪等设备，可以观察到荧光信号的强度和位置。
4. 数据分析：通过荧光信号的强度和位置，可以判断目标物质的存在与否。
荧光信号的强度与目标物质的浓度呈正相关，荧光信号的位置可以反映目标物质在样品中的分布情况。
免疫荧光技术具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优点，广泛应用于生命科学研究、临床诊断等领域。
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学和生命科学领域中的分析技术。
根据不同的用途和操作方法，免疫荧光技术可以分为以下几类：
1. 直接免疫荧光法
直接免疫荧光法是一种最简单的免疫荧光技术，通常用于检测单一抗原。
该方法将荧光标记的抗体直接与待检测物接触，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
2. 间接免疫荧光法
间接免疫荧光法是一种常用的免疫荧光技术，可用于检测多个抗原或抗体。
该方法通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，然后使用荧光标记的二级抗体识别和结合一级抗体，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
3. 间接免疫荧光染色法
间接免疫荧光染色法是一种特定的间接免疫荧光技术，通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，再使用被标记的一级抗体结合一级抗体，形成免疫复合物。
该方法可以用于检测多个抗原或抗体，并且适用于细胞和组织的检测。
4. 光度法免疫荧光
光度法免疫荧光是一种快速、准确的免疫荧光技术，用于检测微量物质，如细菌和病毒。
该方法通过对待测样品进行化学反应，形成荧光物质，然后测量荧光信号强度。
5. 免疫电子显微镜法
免疫电子显微镜法是一种高分辨率的免疫荧光技术，用于检测细胞和分子水平上的抗原或抗体。
该方法使用标记有金颗粒的抗体，进行免疫染色，然后使用电子显微镜观察荧光信号。
总之，免疫荧光技术是一种多功能的生物分析技术，可用于各种生命科学领域，其中不同的分类方法可以根据需要进行选择。
免疫组织化学与免疫荧光技术
免疫组织化学与免疫荧光技术是现代免疫学中不可或缺的技术。
这些技术无论在实验室还是临床应用中都具有重要的意义。
本文将详细介绍免疫组织化学和免疫荧光技术。
一、免疫组织化学免疫组织化学是通过免疫染色技术来检测组织中特定的蛋白质。
这种技术是以抗体和免疫反应的基本原理为基础的。
其原理是识别特定抗原与其结合的抗体。
免疫组织化学在检测肿瘤中常被广泛应用，具有诊断和分型作用。
例如，在乳腺癌中常用到人类表皮生长因子受体2（HER2）的免疫组织化学诊断。
通过使用HER2单克隆抗体来检测HER2蛋白质，可以帮助医生确定病人的治疗方案。
另一个例子是在诊断食管癌时，免疫组织化学可以检测局部淋巴结中是否存在HER2的阳性表达，以协助决定术前的治疗方案。
二、免疫荧光技术免疫荧光技术是一种通过利用荧光染料来检测特定蛋白质的技术。
该技术同样以抗体和免疫反应的基本原理为基础。
免疫荧光技术被广泛应用于微生物、细胞和组织的检测中。
免疫荧光技术可以检测甲型流感病毒、腺病毒等病毒的感染，同时也可以对肺炎支原体等细菌进行检测。
在医学检测中，免疫荧光技术在快速确诊上具有优势。
此外，免疫荧光技术也被广泛用于检测自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、肌无力等疾病。
在SLE的治疗中，抗核抗体“ANA”是常用的诊断标志物，免疫荧光技术能够检测出ANF。
通过免疫荧光技术来检测ANF，可以帮助医生对SLE患者进行诊断。
总结免疫组织化学和免疫荧光技术是现代免疫学中不可或缺的技术。
这些技术可以帮助医生进行生物分子的检测，并为患者的治疗提供准确的诊断。
在这个时代，免疫学将会成为一个重要的领域，并在未来发挥越来越重要的作用。
通过更加深入的研究和使用，我们可以更好地理解免疫系统，并开发出更多免疫学技术，为疾病的早期诊断和治疗提供支持。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
免疫荧光技术(医学相关)
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目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：
异硫氰酸荧光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其 主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
免疫荧光技术
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技术原理
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实验流程
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免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在 细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激 发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。
漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。
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多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术是一种通过特定抗体和荧光染料的结合来检测和定位抗原的方法。
其基本原理是利用抗体的高度特异性和荧光染料的高度敏感性，在光学显微镜下观察和分析。
以下是免疫荧光技术的基本步骤和原理：
1. 样品制备：首先，需要将要检测的样品进行处理和制备。
这可能涉及到细胞培养、组织切片或体液的准备等。
2. 抗体标记：将特异性抗体与荧光染料结合。
荧光染料通常包括荧光素、染料片段（如FITC、Rhodamine等）或其他荧光物质。
3. 样品固定：将样品进行固定，防止抗体和抗原在后续步骤中的失活或破坏。
常用的样品固定方法包括冷冻切片、固定液浸泡和染色等。
4. 抗原检测：将标记过的抗体与样品中的抗原结合。
由于抗体的高度特异性，只有目标抗原与抗体匹配才会发生结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
这可以减少背景信号，提高检测的敏感性和特异性。
6. 观察和分析：将样品放置在显微镜下，使用特定的荧光显微镜进行观察。
荧光染料的激发光源会使标记过的抗体发出荧光信号，这样可以定位和分析抗原的位置、数量和分布。
通过免疫荧光技术，研究人员可以在细胞、组织和体内分析抗原的表达、定位和相互作用。
它在免疫学、生物学、医学和病毒学等领域有广泛的应用，如抗体检测、细胞标记、癌症研究等。
它的高灵敏度和高空间分辨率使其成为了一种重要的研究技术。
免疫荧光技术
免疫荧光技术在肿瘤治疗中的应用：通过检测肿瘤细胞表面的抗原，帮助医生制定个性化的治疗方 案
免疫荧光技术在传染病治疗中的应用：通过检测病原体表面的抗原，帮助医生制定针对性的治疗方 案
免疫荧光技术的 优缺点
优点
灵敏度高：能够检测到低浓度 的抗原或抗体
行标记
荧光信号的检测和成像
荧光信号的产生：通过荧光染料标记抗体或抗原，与靶标结合后产生荧 光信号
荧光信号的检测：使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行检测和定量分析
荧光信号的成像：通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行成像和分析，获得细胞或组织中靶标的分布和表达情况
荧光信号的定量分析：通过对荧光信号的检测和成像，对靶标进行定量 分析和评估，为科学研究和临床诊断提供依据。
蛋白质相互作用研究
免疫荧光技术 可以检测蛋白 质之间的相互
作用
免疫荧光技术 可以定量分析 蛋白质相互作 用的强度和动
力学
免疫荧光技术 可以研究蛋白 质相互作用的
机制和功能
免疫荧光技术 可以应用于药 物筛选和疾病
诊断
疾病诊断和治疗
免疫荧光技术在疾病诊断中的应用：通过检测细胞表面的抗原，帮助医生快速准确地诊断疾病
免疫荧光技术的 发展趋势和未来 展望
发展趋势
自动化：免பைடு நூலகம்荧光 技术将更加自动化， 提高检测效率和准 确性
多重检测：免疫荧 光技术将实现多重 检测，提高检测的 灵敏度和特异性
便携式：免疫荧光 技术将更加便携式 ，方便现场检测和 快速诊断
智能化：免疫荧光 技术将更加智能化 ，实现自动分析和 诊断
免疫荧光实验技术
595～600nm（橙 FITC的衬比染色或双
红色）
标记FAT
四甲基异硫氰酸罗 丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 340nm
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT
575nm（红色） 双标记FAT、流式细 胞术
613nm
时间分辨荧光免疫测 定
免疫荧光技术实验 封闭，抗体孵育
封闭：目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常 用的封闭剂为 BSA, （PBS pH 7.5）,其他可选择的封 闭剂还有 1% 凝胶 gelatin, 1% bovine 或与二抗种 属相同的血清（3-10%）等。室温和4℃均可以。
抗体孵育：直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧 光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育 的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防 止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
免疫荧光技术简介:荧光
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强 度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录 的相应的荧光发射强度。
荧光寿命：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退 称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
荧光显微镜
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免疫荧光技术简介:抗体
抗体（Antibody）：抗体指机体的免疫系统在抗原刺 激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分 泌液中。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
免疫荧光技术
荧光分子的辐射能力在受到激发光较长 时间的照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对 荧光有猝灭作用，因此荧光物质的保存应注意 避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他 化合物的接触。
荧光抗体的制备
作为标记的荧光素应符合以下要求：
①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团， 与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及 其降解产物易于清除。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性 ②酶促反应专一性，保证特异性 ③底物反应放大作用，提高敏感性 ④酶标试剂保存稳定 ⑤操作简便，安全易行
主要试剂的制备与要求
一、酶与酶作用底物
（一）用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原
与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安
标记抗体的纯化：透析法 层析分离法
荧光抗体的鉴定
F/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别
测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素 的特异吸收峰
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光 素越多，反之则越少。一般用于固定标本的 荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色
的以F/P＝2.4为宜。
于自动化，最常用。
2.微颗粒 结合容量大，反应迅速，逐
渐普遍用于自动化分析。
3.膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、尼龙
膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定 量的斑点ELISA。
四、免疫吸附剂
• 免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅 毒特异性诊断常用方法之一。
• 用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情 况。
• 在寄生虫感染诊断中，间接免疫荧光试验 （IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾 抗体的方法。
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四、免疫学方面
该领域应用较多的为间接荧光抗体法，如抗肾上腺皮质抗体、抗肝细胞膜抗
原自身抗体、抗胰岛细胞抗体，抗骨骼肌抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、 抗胃壁细胞抗体、抗肾小球基底膜抗体，抗组蛋白抗体，抗DNA抗体、抗核抗 体等。用该组织制作冷冻切片为底物片用异硫氰酸荧光素标记抗人IgG。
异硫氰酸荧光素(FITC)
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谢谢！
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免疫荧光技术 常用实验类型
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免疫荧光技术在临床检验中的应用
一、细菌学方面
国内纪宝宏根据对854名不同对象的检查,证实麻风间接荧光抗体吸收 （FLA-ABS） 试验对发现麻风亚临床感染有较高的敏感性和特异性,免疫流行 病学调查如同时使用麻风菌素和FLA-ABS试验,可发现以后可能发展为多菌型 麻风的高危人群,即麻风菌素阴性,FLA-ABS阳性者。 庄玉辉用荧光抗休染色检查脑脊液(CSF)内结核菌，阳性率为28.30，而 抗酸染色法阳性率为18,9帕，后者较前者差。结果表明结核菌用荧光抗体检 查技术检查结脑者的CSF显示快速、敏感等优点，对结核性脑膜炎早期诊断 有意义。
Megakaryocytes with or without anti-megakaryocyte antibodies detected by indirect im-munofluorescent methnod
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36例SLE伴血小板减少患者中抗巨核细胞抗体阳 性者占7例(19. 4% ),30例血小板正常的SLE患者中有2 例(6.7%)，而30名正常人对照组中仅有1例(3.3% )， 后者与SLE伴患者血小板减少患者与正常人对照组相 比，差异有显著性。同时我们发现，在血小板减少和 血小板正常的SLE患者中抗巨核细胞抗体阳性病例在 幼稚巨核细胞分类中无差异(2.8%vs3.3%)。 本研究通过检测抗巨核细胞抗体，初步探讨了自 身抗巨核细胞抗体在SLE伴发血小板减少中的作用。
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间接免疫荧光检测 系统性红斑狼疮患者血清抗巨核细胞抗体
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及 多系统、多脏器的自身免疫性疾病，血小板减少是SLE患者较常见的血液 系统表现之一。自身免疫因素被认为是引起血小板减少的主要原因。有 文献报道，抗血小板抗体、抗磷脂抗体等自身抗体可造成外周血中血小 板破坏或凝集，导致循环血小板减少。
免疫荧光技术
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免疫学方法：抗原抗体特异结合
荧光标记技术：利用一些能发射荧光的物质共价 结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上， 利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。
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免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的准确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但 不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗 体复合物及其存在部位。
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
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五、肿病细胞及其它
翟春玺、张风菊研究表明，癌细胞胞浆中所含RNA较正常细胞显著增多 ，AO能与RNA结合成AO-RNA复合体，显红色荧光，RNA愈丰富其红色荧 光愈强。胞核所含的DNA较正常细胞显著增多，DNA与AU结合成AO-DNA 复合体，呈绿色荧光，同时DNA含量愈丰富，其绿色荧光愈强。核仁是RNA 成分，呈红色荧光，癌细胞可显示绿色胞核，红色核仁，新鲜深红色胞浆， 成为对照鲜明的荧光图象。 其它，免疫荧光法定量检查非妊娠血清的胎盘蛋白5单克隆抗休荧光抗体 优化试剂检测沙眼衣原体，应用双色荧光标记单克隆抗体和流式细胞计鉴定 移植肾组织的单个核细胞浸润，用荧光灶测定法快速诊断甲型和乙型流感病 毒，韦荣氏球菌以紫外线照射出现荧光。
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抗巨核细胞抗体荧光检测方法
取出冷冻骨髓玻片
室温晾干
滴加PBS(PH7. 4 ) 10%兔血清封闭骨髓标本
加入待测血清样品
PBS洗涤
稀释的FITC兔抗人IgG抗体
30min
37℃避光
PBS洗涤
观察
5min
1:1的瑞氏染液+磷酸缓冲液
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检测结果
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A ：blank control B：case of negative anti-rnegakaryocyte antibody C:： case of positive antimegakaryocyte antibody
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二、真菌学方面
国内采用荧光染色：皮屑、甲屑、毛发等标本经20%KOH溶液处理后加少 量0.1%吖啶橙染液，盖以盖玻片，微微加温（脓、痰、尿、脊髓液或分泌物直 接涂片加少许1%吖啶橙染液加盖玻片），置荧光显微镜下观察菌丝或孢子的荧 光反应，阳性证明有真菌存在，但不能确定菌种。
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三、寄生虫方面
国内1976年83118部队医院防疫所应用轻便荧光光源及吖啶橙染色检查疟原 虫。在荧光显微镜下，疟原虫及白细胞的核呈明亮的黄绿色荧光，疟原虫和淋巴 细胞的浆呈红色荧光，正常红细胞不着色。在暗绿色视野中，白细胞如夜空中的 明月一般，疟原虫的核象亮晶晶的星星，疟原虫的核浆与西蒙氏染色结果基本一 致，能清楚辨别环状体、滋养体、裂殖体各期。 国外Ckman LRR用可吮橙染色离心寄生虫快速诊断疟疾。疟原虫在紫外光 源下观察，核呈绿色(DNA ),胞质呈橙色(RNA)。
免疫荧光技术及其 在临床检验中的应用
Hale Waihona Puke 免疫荧光技术又称荧光素标记技术，是指将免疫学方 法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布 的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从 而可对抗原进行细胞定位。它是在免疫学、生物化学和显微 镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫学方法
荧光标记技术