高效液相色谱法测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量 (2)

结 合 心 脑 血 管 病 杂 志 ，２００５，３（５）：４３４ ［４］ 王浴生，邓文龙，薛春生．中药药理与应用［Ｍ］．北京：人民卫
生 出 版 社 ，２０００：７１４ ［５］ 郁建生．分光光度 法 测 定 复 方 草 珊 瑚 注 射 液 中 总 黄 酮 含
量 方 法 的 探 讨 ［Ｊ］．中 医 医 药 杂 志 ，２００２，（３）：４１ ［６］ 曹春林，施顺清．中药药剂学［Ｍ］．上海：上 海 科 学 技 术 出 版
乙 醚 、 氯 仿 、 甲 苯 、 石 油 醚 、 乙 酸 乙 酯 ： ＡＲ； 浓 硫 酸 、 氨 水 ： ＣＰ； 蒸 馏 水 ； Ｍａｙｅｒ 试 剂 ； 重 铬 酸 钾－ 浓硫酸试剂； 显色剂： 改良碘化铋钾（Ｄｒａｇｅｎｄｒｏｆｆ） 试剂； 标准品： 钩藤碱。 １．３ 药材
２００６年４月采自广东省云浮市， 经广东药学院中 药学院曾常青副教授鉴定为钩藤。 １．４ 钩藤总生物碱的提取 １．４．１ 钩 藤 中 总 生 物 碱 的 提 取 称 ５份 药 材 粗 粉 （１４ 目）各５００ｇ， 分别置于５个５０００ｍＬ圆底烧瓶中， 各加入 氨水－ 水（１∶９）溶 液 使 药 材 湿 润 并 放 置３０ｍｉｎ， 再 分 别 以乙酸乙酯、氯仿、乙醚、甲苯和石油醚与乙酸乙
占百分 比（％） ０．３２ ０．４１ ０．４２２ ０
０．３７２
结果见表１。根据文献报道， 钩藤中总生物碱的提取 量基本在０．４％， 本实验结果表明， 在５种有机溶 剂中 氯仿与乙醚的提取效果最好， 是提取钩藤总生物碱 的适宜溶剂。 ２．２ 钩藤总生物碱的鉴定及成分分析
取４种不同溶剂提取物作薄层色谱， 在紫外灯下 Ａ
收稿日期： ２００７－ ０１－ １９ 作者简介： 李维锋（１９８２－ ）， 男， 河南济源人， 硕士研究生， 研究方向为糖类物质及其药物的制备与生物利用。
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１ 实验部分
１．１ 仪器 设备电热套； 调压器； 水 泵 ； Ｓ１１－ ４－ Ⅱ／电 热 恒
温水浴锅； Ｘ－ ６显微熔点测定仪： 北京泰克仪器有限 公 司 ； 日 本 岛 津ＬＣ－ １０ＡＤ高 效 液 相 色 谱 仪 ； ４８８２型 三用紫外分析仪 ： 上 海 顾 村 电 光 仪 器 厂 ； ｐＨＳ－ ２５型 酸度计： 上海伟业仪 器厂； ＲＥ－ ５２Ｓ旋 转 蒸 发 仪 ： 巩 义市英予华仪器厂； 各种型号的玻璃仪器。 １．２ 试剂
法： 用不同的溶剂提取大叶钩藤的总生物碱， 柱层析分离得到钩藤碱晶体， 用ＨＰＬＣ测定晶体的纯度。
结论： 溶剂的选择直接影响总生物碱的提取量， 氯仿是大叶钩藤总生物碱工业化提取的适宜溶剂， 用
通 过 柱 层 析 可 以 得 到 纯 度 高 达 为９５．４９％的 钩 藤 碱 晶 体 。
关键词： 大叶钩藤； 总生物碱； 提取溶剂； 钩藤碱
大叶钩藤Ｕｎｃａｒｉａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗａｌｌ．类属茜草科钩 藤属植物， 为常用中药。自古用作清热平肝、息风 镇惊药， 用于治疗头晕目眩、惊痫抽搐、全身麻木 等心脑血管和神经系统疾病， 现已成为治疗高血压 方剂中常用药物［１］。现代药理研究表明， 钩藤药理作 用的有效成分主要是生物碱， 其中钩藤碱和异钩 藤碱等吲哚类生物碱为主要有效成分。钩藤碱占 总 碱 的２８．９％， 毒 性 低 ， 副 作 用 小 ， 具 有 良 好 的 药 用 疗效［２］。由于钩藤碱的热稳定性较差， 在８１℃时 即 有部分分解， 其酯键受热易分解， 并在极性条件下 易转化为异钩藤碱， 转化率在６０％以上［３］。因 此 ， 本 实验未采用酸水提取法， 而采用了有机溶剂提取法， 对常用的有机溶剂乙酸乙酯、氯仿、乙醚、甲苯、 石 油 醚 与 乙 酸 乙 酯 混 合 溶 剂 （５：３）对 钩 藤 总 生 物 碱 的 提 取进行了实验研究， 确定工业化提取的最佳溶剂， 并对总生物碱进行分离纯化， 得到钩藤碱并鉴定其 纯度。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ： Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｓ ｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｕｎｃａｒｉａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗａｌｌ ｉｎ ｉｎｄｕｓ ｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌｉｎｅ ｉｓ ｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ． Ｍｅ － ｔｈｏｄｓ ： Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｉｎ Ｕｎｃａｒｉａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗａｌｌ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓ ｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓ ｏｌｖｅｎｔｓ ． Ｒｈｙｎ－ ｃｈｏｐｈｙｌｌｉｎｅ ｗａｓ ｓ ｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｂｙ ｄｒｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｐｕ－
ＬＩ Ｗｅｉ－ ｆｅｎｇ１， Ｊ ＩＡＮＧ Ｊ ｉａｎ－ ｇｕｏ１， Ｗａｎｇ ＤＩＮＧ－ ｙｏｎｇ２， ＣＨＥＮ Ｊ ｉａｎ１， ＬＩ Ｙａｎ－ ｍｉｎ１
（１．Ｓ ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓ ｔｒｙ ａ ｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ ， Ｓ ｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ｏｆ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕａ ｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０； ２．Ｐ ｈａ ｒｍａ ｃｙ Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ， Ｇｕａ ｎｇｄｏｎｇ Ｐ ｈａ ｒｍａ ｃｅ ｕｔｉｃａ ｌ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６）
社，１９８９：３９６
１５６ Ｎｏ． ８． ２００７
工艺技术
ｒｉｔｙ ｂｙ ＨＰ ＬＣ． Ｒｅｓ ｕｌｔｓ ： Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓ ｏｌｖｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓ ｏ ｄｉｓ ｔｉｎｃｔｉｖｅｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ． Ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｓ ｏｌｖｅｎｔ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌｉｎｅ ｓ ｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｌｋａ－ ｌｏｉｄｓ ｗａｓ ９５．４９％． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｕｎｃａｒｉａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗａｌｌ； ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓ ｏｌｖｅｎｔ； Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌｉｎｅ
中图分类号： ＴＳ２０１
文献标识码： Ａ
文章编号： １００５－ ９９８９（２００７）０８－ ０１５６－ ０３
Ｓ ｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓ ｏｌｖｅ ｎｔｓ ｅ ｘｔｒａ ｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａ ｌ ａ ｌｋａ ｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｕｎｃａ ｒｉａ ｍａ ｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗａ ｌｌ ａ ｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌｉｎｅ
脂（５∶３）混合溶剂， 用电热套加热， 回流提取５次（第１次 所用溶剂量为２５００ｍＬ， 以后每次用２０００ｍＬ）， 每次加 热 回 流５ｈ， 温 度 调 节 为 溶 剂 微 沸 。 将 每 次 提 取 液 过 滤 ， 合 并 滤 液 ， 减 压 浓 缩 至１０００ｍＬ， 置 于 分 液 漏 斗 中， 用硫酸（５０％硫酸∶水＝１∶３００）溶液２００ｍＬ萃取， 共５ 次。合并酸水液， 过滤， 滤液用氨水碱化至ｐＨ９￣１０， 再用原相应于提取溶剂的溶剂萃取５次， 每次用溶剂 ２００ｍＬ。合并萃取液， 过滤， 减压回收溶剂至干， 于 ６００℃烤箱中烘烤至质量恒定， 称质量。 １．４．２ 薄层层析法分离、鉴定生物碱［４］ 将硅胶ＧＦ２５４ 薄层板在１０５℃活化３０ｍｉｎ， 分别取乙酸乙酯、氯仿和 乙醚提取的总生物碱及少量钩藤碱标准品， 以氯仿 溶解， 点于活化的硅胶板上， 以石油醚∶乙酸乙酯＝５∶ ３为展开剂， 置于紫外灯下检识。 １．５ 钩藤中钩藤碱的分离及其性质鉴定
取少量钩藤碱晶体观察其性状、颜色、水溶性， 使 钩 藤 碱 的 氯 仿 溶 液 分 别 与Ｄｒａｇｅｎｄｒｏｆｆ试 剂 、Ｍａｙｅｒ 试剂和重铬酸钾－ 浓硫酸试剂反应， 观察现象。 １．６ 样品纯度测定
用ＨＰＬＣ方法鉴定得到的晶体（钩藤碱）的纯度。色 谱 条 件 为 色 谱 柱 ： ｐＨ稳 定 性 １．５－ １０的 ＰｈｅｎｏｍｅｘｎｅＣ１８ 柱（５μｍ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）； 流动相： 甲醇－ ０．０４ｍｏｌ／Ｌ三 乙胺（ＨＡＣ调节ｐＨ至１０）＝（７０∶３０）； 流 速０．８ｍＬ／ｍｉｎ； 检 测 波 长２５４ｎｍ； 柱 温 室 温 ； 运 行 时 间４０ｍｉｎ； 进 样 量 １０μＬ。
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Ｂ
Ｃ
Ｄ
注： Ａ： 乙酸乙酯提取的总生物碱； Ｂ： 氯仿提取的总生物碱； Ｃ： 乙 醚提取的总生物碱； Ｄ： 石油醚与乙酸乙酯（ ５∶３） 混合溶剂提取的总生物碱； Ｏ： 钩藤碱的标准品。
图１ 各有机溶剂提取钩藤总生物碱的硅胶Ｇ薄层色谱图
检识， 各提取物在与钩藤碱标准品相同位置上有紫 红色斑点 （ 见图１） 。由图１可知， 用薄层层析法分离 氯仿提取的总生物碱， 共可分离出４种成分。据相关 文 献 ［５］可 知 ， 钩 藤 总 生 物 碱 中 包 含 有 ４ 种 生 物 碱 ， 即： 钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛、柯诺辛Ｂ。而钩藤 碱的一般性质， 见表２。 ２．３ 钩藤碱的ＨＰＬＣ的检测结果
２ 结果
２．１ 钩藤总生物碱不同提取溶剂的结果 采取不同的溶剂对钩藤中的总生物碱进行提取，
Ｎｏ． ８． ２００７ １５７
工艺技术
表１ 不同溶剂提取钩藤总生物碱的结果
溶剂 名称
乙酸 乙酯
氯仿
乙醚 甲苯
石油醚与乙酸乙酯 （５∶３）混 合 溶 剂
总生物
碱量（ｇ） １．５１ ２．０５ ２．１１ ０
１．８６
成分 状态 钩藤碱 针状
晶体
表２ 钩藤碱的一般性质
颜色 无色
Ｄｒａｈｅｎ－ ｄｒｏｆｆ试 剂
橙黄色 沉淀
Ｍａｙｅｒ 重铬酸钾－ 浓 试剂 硫酸试剂
白色 橙色转为黄
沉淀
绿色
本次实验所得产品为无色针晶和无色柱晶， 针 晶的熔点为２０８￣２０９℃， 柱晶的熔点为２０４￣２０５℃。高 效 液 相 色 谱 检 测 保 留 时 间 为 ２３．４４５ｍｉｎ， 纯 度 为 ９５．４９％， 见图２。
下存放。
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ＡＵ
０．１５
０．１０ ０．０５ ０．００
５．００ １０．００ １５．００ ２０．００ ２５．００ ３０．００ 时 间 （ｍｉｎ）
称 取 药 材 粗 粉 ５００ｇ， 先 用 ｐＨ９ ￣１０ 氨 水 润 湿 ， ３０ｍｉｎ后 ， 用２５００ｍＬ氯 仿 回 流 提 取５次 ， 每 次５ｈ。 提 取液浓缩到原来体积一半， 再用硫酸（５０％硫酸∶水＝１∶３００） 萃取， 萃取至氯仿层溶液的碘化铋钾反应呈阴性。 然后用浓氨水将 酸 萃 取 液 的ｐＨ值 调 至９￣１０， 即 有 大 量白色沉淀析出， 再用氯仿萃取水层至水层对碘化 铋钾反应呈阴性。滤集沉淀并在４０℃下真空干燥， 得 到钩藤总生物碱。将总生物碱干法上硅胶柱， 石油 醚／乙酸乙酯梯度洗脱， 收集钩藤碱部分洗脱液， 经 石油醚／乙酸乙酯重结晶可得到针状的钩藤碱晶体。
工艺技术
大叶钩藤总生物碱提取溶剂的 研究及钩藤碱的纯度测定
李维锋１， 姜建国１， 王定勇２， 陈 健１， 李艳敏１ （１．华南理工大学轻工与食品学院， 广州 ５１０６４０；
２．广州药学院药科学院， 广州 ５１０００６）
摘要： 目的： 筛选大叶钩藤总生物碱工业化提取的适宜溶剂， 分离纯化得到钩藤碱并测定其纯度。方