大蒜素粉微生物限度检查方法验证

大蒜素粉微生物限度检查方法验证

魏鸿雁1*，谢志军2，贾晓光1*

（1新疆中药民族药研究所乌鲁木齐 830002， 2国药集团新疆制药有限公司乌鲁木齐 830032）

[摘要] 目的：建立冻干蒜粉的微生物限度检查方法。方法：采用《中国药典》2010年版收载的微生物限度检查方法的薄膜过滤法、离心集菌法进行验证。结果：大蒜素粉对细菌和真菌均有很强的抑制作用，为了消除药物抑菌活性对实验结果的干扰，可采用薄膜过滤法进行细菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，采用离心集菌法进行大肠埃希菌的检查。结论：大蒜素粉具有抑制活性，须采用特殊方法消除药品的抑菌活性才能检测样品中微生物的真实含量。

[关键词] 大蒜素粉；微生物限度检查；验证；薄膜过滤法

Verification of Methodology on the Microbial Limit Test for Alltride powder

WEI Hong-yan1, XIE Zhi-jun2, JIA Xiao-guang1*

(1.Xinjiang Institute of TCM and National Drugs,Urumqi 830002,China;2 Sinopharm Group Xinjiang Pharmaceutical CO.,LTD. Urumqi 830032,China.)

[Key words]:Alltride powder; Microbial Limit Test; Verification of Methodology; Membrane filtration method.

大蒜素粉为百合科植物大蒜Allium Sativum L.鳞茎的冷冻干燥粉末，通常称作冻干蒜粉，是一种生物活性药食两用制品，完全保留鲜蒜全部有效成分。本品对多种球菌、百日咳杆菌、白喉杆菌、痢疾杆菌、伤寒及副伤寒杆菌、大肠杆菌、结核杆菌等有抑制和杀菌作用。对真菌感染有抑制作用。对阿米巴原虫、阴道滴虫、蛲虫等也有抑制和杀灭作用。主要功能为解毒、杀虫、止痢[1] [2] [3]。

由于大蒜素粉有杀菌抑菌作用，对微生物的生长有干扰[1]，按常规方法测定其微生物限度无法保证其准确性，必须选择合适的方法消除其供试液的抑菌活性后，再

基金项目：国家支撑计划项目“维吾尔医药的现代化研究与产业化示范”（2007BAI30B03）

作者简介：魏鸿雁（1969-）,女,副研究员，全国执业药师。从事中药民族药研发工作。Tel：(0991)2662160 E-mail：whywlmq@

通讯作者简介：贾晓光（1954-）,男,研究员。从事中药民族药研究工作。Tel：(0991)2633141。

依法检查，才能检测出大蒜素粉中的真实含菌量[4]。本实验采用薄膜过滤法进行细菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，采用离心集菌法进行大肠埃希菌的检查，为确保检验方法的准确性和可靠性，对以上方法进行了计数方法及检查方法的验证。

1 实验材料

1.1 器材薄膜过滤器(海宁市亚泰制药机械有限公司)；LDZX-40立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；LRH-250生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；SHH-250JS 霉菌培养箱(重庆万达公司公司)；SW-CJ-1B型标准净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）； HTY-761型匀浆仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)等。

1.2菌种大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕；金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕；枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕；白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕；黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕均购于新疆维吾尔自治区食品药品检验所。

1.3 培养基及稀释剂营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、胆盐乳糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基，以上培养基均由北京三药科技开发公司提供；含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液、0.9%灭菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等为新配。

1.4 供试品大蒜素粉（新疆天和保健品有限公司生产，批号为0904097）

2 实验方法与结果[4] [5]

2.1 试验菌株菌悬液的制备

2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物接种至营养肉汤培养基，30～35℃培养18～24h,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml的菌悬液。

2.1.2 白色念珠菌菌悬液取白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁培养基，23～28℃培养24～48h。用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml的菌悬液。

2.1.3 黑曲霉菌菌悬液取黑曲霉菌新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，23～28℃培养5～7d。用含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液8ml，将孢子洗脱至无菌试管中，用含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml 的孢子悬液。

2.1.4 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾

3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠

4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

2.2 供试液的制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,匀浆仪2000r/min混合30s，制备成1:10的供试液。

2.3 细菌总数、霉菌及酵母菌总数检查方法的验证

2.3.1 试验组平皿法与培养基稀释法分别取各稀释倍数的供试液1ml各注入两个平皿，加入50～100cfu试验菌，立即注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，做菌落计数。

2.3.1.1 平皿法：取供试液1ml/皿，分别污染上述5种代表试验菌株，再加15～20ml 规定的培养基，凝固后置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。

2.3.1.2 培养基稀释法：取供试液0.2 ml/皿，0.1ml/皿，分别污染50～100cfu/ml 试验菌株，再加15～20ml规定的培养基，凝固后置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。

2.3.1.3 薄膜过滤法：取供试液1 ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml 混匀，过滤。每支滤筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗，共3次。冲洗后取出滤膜，贴膜测定。阳性对照在最后一次冲洗时分别污染50～100cfu/ml试验菌株，置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。

2.3.2 菌液组另取两个平皿，不加供试品，分别加入50～100cfu试验菌，平行两个平皿，立即注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，做菌落计数。

2.3.3 供试品对照组取相应稀释级试验组等量的供试品至培养皿中，平行制备两个平皿，不加菌液，注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，测定供试品本底菌数。

2.3.4 验证试验至少进行3次独立平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。

2.3.5 菌回收率的计算

试验组菌的回收率（%）= 试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数

×100% 菌液组的平均菌落数

2.3.4 结果

表1 污染菌回收率

金铺球菌% 枯草芽孢杆菌% 大肠埃希菌% 白色念珠菌% 黑曲霉菌% 1ml/皿0 0 0 0 0 0.2ml/皿0 0 0 0 0 0.1ml/皿0 28 69 0 0