大蒜素粉微生物限度检查方法验证
微生物限度检查方法适用性验证方案
微生物限度检查方法适用性试验方案验证方案组织与实施微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。
方案起草方案审核方案批准目录一、概述二、验证目的和风险评估三、验证内容四、方法判定五、再验证周期六、参考文献七、结果评价及结论1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。
2、试验目的和风险评估：验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。
风险评估：3、验证内容：3.1、培养基来源：确认人：确认日期：3.2、检查用培养基配制方法：确认人：确认日期：3.3、使用仪器确认人: 确认日期：3.4、验证试验用菌种：确认人：确认日期：3.5试验方法：取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液的制备：3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
2020微生物限度检查方法验证方案
2020微生物限度检查方法验证方案
2020微生物限度检查方法验证方案的具体步骤如下：
1. 确定验证样品：选择与待验证方法相似的样品，确保样品中含有合适的微生物，并且样品中不含任何可能影响验证结果的其他因素。
2. 准备验证样品：收集足够数量的样品，并且确保样品没有受到外界污染。
然后将样品分为若干等份，每份使用不同的验证方法进行检测。
3. 进行验证测试：按照待验证方法和验证方法的流程进行操作，进行微生物限度检查。
确保每一步操作准确无误，并且严格控制所有可能的干扰因素。
4. 检测结果分析：根据检测结果，对比待验证方法和验证方法的结果，评估两种方法的准确性、可靠性和适用性。
5. 数据统计和处理：对验证结果进行统计分析，包括计算平均值、标准差等。
如果有需要，可以使用统计学方法进行数据处理。
6. 结果评估：根据统计分析的结果，评估待验证方法和验证方法之间的差异。
如果验证方法的结果与待验证方法一致并且符合要求，则认为验证成功。
7. 编写验证报告：根据验证结果，编写验证报告。
报告应包含验证方法的详细
描述、样品信息、检测结果和分析、结论等内容。
以上是2020微生物限度检查方法验证方案的一般步骤，具体步骤可能会因实验目的、样品特性和验证要求等而有所不同。
在进行验证前，应仔细阅读国家相关规定和标准文件，确保验证过程符合法规要求。
同时，为了确保验证结果的准确性和可靠性，建议在验证过程中进行合适的实验室质量控制，例如采用质控菌株、系统重复性分析等。
微生物检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1、概述2、验证目的3、验证条件4、验证步骤5．验证试验小结1.概述微生物限度为产品质量的一个重要指标，其检查方法的选择对检验结果真实性有很大的影响，为此必须对其检查方法进行验证。
2.验证目的通过对微生物限度检查方法的验证，确认在正常条件下本检验方法处于控制状态，且能够稳定地对公司产品进行有效的微生物的检查和控制。
确认相应标准操作规程的适用性。
3.验证条件3.1验证小组成员与分工3.2 参加本方案实施操作的人员须事先进行《微生物限度检查标准操作程序》的培训，能熟练掌握检查方法和原理，熟悉本方案的内容。
3.3验证所用的各类物料均应符合相应的规定或标准。
相应的设备须验证的应事先进行验证并符合要求。
4.验证步骤4．1验证依据参照2010年版《中国药典》微生物限度检查计数方法的验证4．2与验证有关的文件《微生物限度检查标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-010《净化工作台标准操作程序》文件编号：SOP-ZL-0324．3验证用材料4．3．1试验样品药品包装用复合膜产品4．3．2实验菌株1．金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]2．大肠埃希菌[CMCC（B）44102]3．枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]4．白色念株菌[CMCC（F）98001]5．黑曲霉[CMCC（F）98003]以上菌株购自省药品检验所。
4．4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证4．4．1验证方法4．4．1．1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，培养18～24小时；接种白色念株菌至改良培养基中，培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100CFU的孢子悬液，备用。
大蒜素检测方法
大蒜素研究进展21.GC及GC-MS联用最低检测限0.2ng 为避免被测物在高温条件下分解，柱温不易过高，适宜温度为70℃；GC-MS可以测出大蒜油中各种组分及含量最低检测限为0.005g/100g2. 高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法克服了气相色谱法中温度高, 不稳定的缺点, 柱温可控制在较低温度, 大蒜素的检测一般采用反相高效液相色谱法。
测定波长为240 nm。
该方法最低检测浓度为0. 18 g /mL3.定硫法定硫法的原理[ 16] 是大蒜中蒜氨酸的亚砜基和大蒜素的硫代亚砜基被浓硝酸氧化成硫酸离子, 与氯化钡反应形成硫酸钡沉淀, 根据硫酸钡的重量换算出大蒜素的含量。
在定硫法中, 氧化剂的用量, 酸度和沉淀剂用量等因素都会对测定结果产生影响。
氧化剂用量在2. 0~ 5. 0 mL之间较好, 氧化剂量过多或过少都会使测定结果偏低, 测定溶液的酸度值在2. 0~ 3. 0之间最佳, 沉淀剂用量在5~ 30 mL之间对测定结果影响较小。
在大蒜素保健食品中常用该方法进行大蒜素含量测定4.分光光度法在一定温度下大蒜素在蒜酶的作用下水解产生丙酮酸, 可以利用测定丙酮酸含量的方法测定大蒜中大蒜素的含量。
丙酮酸可以和2, 4- 二硝基苯肼作用生成丙酮酸- 2, 4 - 二硝基苯腙沉淀。
利用分光光度计对苯腙进行比色分析, 测出消光值D, 在D- C 标准曲线上找出对应的苯腙浓度, 从而换算出大蒜素的含量。
除此之外, 还可以通过测定半胱氨酸的含量从而计算出大蒜素含量。
其原理是基于一分子的大蒜素会与两分子的半胱氨酸发生反应, 可以通过过量的半胱氨酸与大蒜素反应, 用5, 5 -'二硫代双( 2- 硝基苯甲酸) 法测定反应前后半胱氨酸的量, 根据半胱氨酸减少量计算大蒜素含量。
结果为大蒜素平均含量0. 270 mmol/100g。
5. 其他方法除以上方法外, 还有生物检测法, 薄层扫描法, 硝酸汞沉淀法, 适用于定性分析。
保健食品中大蒜素的测定方法验证
保健食品中大蒜素的测定方法验证作者：刘昶李宁李镇宏来源：《健康周刊》2018年第04期【摘要】根据《保健食品检验与评价技术规范》2003版，通过GC-FID进行测定，对大蒜素的测定项目进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验）的验证，通过重复性试验和回收率试验验证检验过程的回收率和重现性，并确定大蒜素的线性范围、定量限，用以确定GC-FID法的适用性及可控性。
【关键词】保健食品、大蒜素、方法学验证引言大蒜素（大蒜新素、garlicin）为三硫代烯丙醚类化合物，天然存在于百合科植物大蒜的鳞茎中。
对多种革兰氏阳性和阴性菌均有抗菌作用，对骨髓移植者并发巨细胞病毒感染有明显防治作用。
尚有降低血胆固醇、甘油三酯和脂蛋白以及抗血小板凝集、抗肿瘤作用，成为近年来较受关注的保健食品功效性成分和特征成分。
因此，对于第三方检测机构，以大蒜素等功效成分为例的保健食品的检测中蕴藏着大量的商机。
1 试验方法1.1 色谱条件HP-5柱（30m*250μm*0.25μm），程序升温：初始温度为50℃，以30℃/min的速率升至160℃，保持3分钟，以100℃/min的速率升至230℃，保持3分钟。
进样口温度180℃，分流比10：1；检测器温度180℃。
1.2 大蒜素标准液（1）储备液：准确称取大蒜素标准品适量，用正己烷稀釋，使得溶液浓度为10mg/mL。
（2）工作曲线：取标准储备液，用正己烷配制稀释成浓度为0.02，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00mg/mL的标准工作溶液。
1.3 供试品溶液称取1.0g样品（以大蒜软胶囊为例），于10mL量瓶中，加入5mL正己烷，超声提取30min，用正己烷定容，振摇后静置，经0.45μm滤膜过滤后待测。
2 结果与讨论2.1 精密度试验分别精密吸取大蒜素标准工作溶液的最高点和最低点各1μL，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查法验证方案1。
目的:为确认所采用的方法适用于药品微生物限度检查，包括细菌、霉菌、酵母菌和对照菌的计数，特制定本验证方案。
通过比较试验菌的复苏生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性，从而确定试验样品在实验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。
所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本计划规定的内容进行。
因特殊原因确需变更的，应填写《验证计划变更申请书》，报验证领导小组批准。
2.范围: 本验证计划适用于微生物限度检查方法的验证。
3。
规范性引用文件:根据《中国药典》XXXX版附录二附录九J微生物限度检查法的要求，由于部分试验品的抗菌活性，当已建立的微生物检查方法或产品的成分发生变化或原检查方法的检查条件发生变化时，可能会影响检查结果的准确性。
因此，必须验证测试物品的抗菌活性和测试方法的可靠性。
4.验证和实施:4.4.1试验前准备:4.4.1.1试验设备的准备:试管、刻度移液器、薄膜过滤器、滤膜(孔径0.22um，直径50毫米)、平皿、空三角瓶、称重纸等。
试验要求用牛皮纸包裹，放在湿热灭菌器中，在121℃灭菌30分钟，3天内使用4.4.1.2试验培养基的制备:取脱水培养基如营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)等经适用性检验合格的脱水培养基，按相应的制备说明用纯净水配制，分装，2小时内放入湿热灭菌器中，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.1.3试验用稀释液/缓冲液和冲洗液的配制:取有效期内的试剂，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(毫升/毫升)聚山梨酯80无菌氯化钠溶液和0.05%(毫升/毫升)0.9%氯化钠溶液等。
按照相应的制备方法，用纯净水配制，加热溶解，过滤，分装，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.2试验菌的制备和稀释:4.4.2.1细菌、霉菌和酵母菌计数法验证菌液:4.4.2.1.1取少量新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，接种于10毫升营养肉汤中，在30-35℃培养18-24小时；将新鲜白色念珠菌培养物接种到改良的马丁培养基中，在23-28℃培养24-48小时；将黑曲霉的新鲜培养物接种到改良的马丁琼脂斜面培养基上，在23-28℃培养5-7天4.4.2.1.2将上述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的均匀培养物(细菌悬液)用0.9%无菌氯化钠溶液稀释两次，以制备每毫升细菌含50-100伏的测试细菌溶液。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
微生物限度方法验证报告范文
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微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证微生物限度方法学验证是指通过一系列的实验和分析，确定某一产品或样品中所含微生物的数量和种类。
它是一种质量控制的重要手段，用于评估产品的微生物污染情况，确保产品符合安全要求。
微生物限度方法学验证通常包括以下几个步骤：1. 确定样品的限度：首先，需要确定限度的范围。
在国家标准和相关规范中，通常会对不同产品的微生物限度进行规定，根据产品的特性和用途，设定了不同的限度要求。
因此，在进行验证之前，需要先明确所要验证的产品的限度。
2. 提取样品：根据所要验证的产品特性，选择适当的方法提取样品。
提取样品的目的是将样品中的微生物完全释放出来，以便后续的实验分析。
3. 预培养或净化：在某些情况下，样品中的微生物数量非常少，无法直接进行分析。
此时，需要进行预培养或净化操作，增加微生物数量或减少其他杂质的干扰。
预培养可以使用适当的培养基，为微生物提供生长所需的营养物质和条件。
净化操作可以通过滤膜、离心等方法，将大部分的杂质去除。
4. 微生物分离和鉴定：将样品进行稀释处理，并分别均匀涂布在适当的培养基上。
在一定的时间和温度条件下，培养基上会出现不同形状和颜色的菌落。
通过观察菌落的特征、形态学和生理学测试，可以大致判断出菌落所属的微生物种类。
5. 统计分析：通过对微生物菌落进行计数，并根据所设定的限度要求进行统计分析。
常用的统计方法包括平板计数法、薄膜过滤法和浸入法等。
统计分析的结果可以得知样品中微生物的数量和种类，进而判断样品是否符合限度要求。
6. 结果判定：根据统计分析的结果，结合所设定的限度要求，判断样品是否合格。
如果样品中的微生物数量和种类在限度范围内，并且符合相关标准要求，那么样品可以被认为是合格的。
微生物限度方法学验证具有一定的复杂性和技术难度，需要操作人员具备一定的实验室技术和知识。
同时，验证过程中要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，验证结果需要及时记录和整理，以便对产品质量的稳定性进行评估和改进。
微生物限度检查方法的验证
ygfyzy 整理
微生物限度检查方法的验证
包括: 1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证——专属性 3.实例
一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
1.验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照
此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验 结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： •根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 •保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 •按制定的方法进行试验。 •根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条 件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进 行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法 及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进 行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3. 验证用菌株： 细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。 霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
回收率均能达到 70%以上的检测方法为准。 霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达
到 70%以上的检测方法为准。 11.4 计数方法的验证——结果判断
在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。
若试验组的菌回收率均不低于 70%，则按此供试液制备方法和计数 法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。
(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7， 使菌数约为 50～100cfu/ml。
微生物限度检验方法验证报告
微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。
稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。
7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。
附录。
验证记录范本
验证记录工厂代号：工厂地址：
出口食品HACCP计划审核报告
附：
油脂在生产过程中酸价和过氧化值的变化的确认
因为油脂的酸价和过氧化值是衡量油质是否酸败的重要指标，如果油质已经酸败，则可能影响人健康。
以下是我们通过实验并经过仔细的分析确认的结果。
我们油质为椰子油质，其原料的酸价和过氧化值标准为：酸价〈1mg/g，过氧化值〈5meq/kg。
而我们制定的成品大蒜素的酸价和过氧化值得标准为酸价〈5mg/g，过氧化值〈15meq/kg。
我们做了大量的实验，（见理化检验结果）。
按照正常的生产方式进行生产，当反应12小时后，并进行检测得到结果为酸价〈0.4mg/g，过氧化值〈5meq/kg。
当反应24小时后，并进行检测得到结果为酸价〈0.5mg/g，过氧化值〈6meq/kg。
反应36小时检测得到结果为酸价〈0.5mg/g，过氧化值〈7meq/kg。
反应48小时检测得到结果为酸价〈0.5mg/g，过氧化值〈9meq/kg。
我们对以上的结果进行了分析（见酸价和过氧化值变化曲线分析），经过分析我们确认按照我们正常生产，反应24小时后酸价和过氧化值不可能超标。
所以我们在正常生产中酸价和过氧化值不可能超过标准，不必要作为关键控制点进行控制。
（附检验报告）
确认人员签字：。
国家局关于征求保健食品中大蒜素的测定等15个保健食品功效成分或标志性成分检测方法意见的函
附件：一、保健食品中大蒜素的测定1 范围本方法适用于以大蒜及其制品为原料的保健食品中大蒜素（三硫二丙烯，C6H10S3）的含量测定。
本方法最低检出浓度为0.0430mg/mL；取100mg试样，提取定容5.0mL时，试样中大蒜素最低检出质量浓度为0.20g/100g。
本方法最佳线性范围： 0.320mg/mL～3.00 mg/mL。
2 原理：根据大蒜素为挥发性油成分，经有机溶剂提取，用气相色谱仪分析，采用外标法定量。
3 试剂除特殊说明，所用试剂均为分析纯。
3.1 无水乙醇3.2 正己烷3.3标准溶液：称取0.1000g标准品，置于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，该溶液中含大蒜素浓度为10.0mg/mL。
此溶液可在冰箱中保存七天。
取该溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，此溶液含大蒜素浓度为1.0mg/mL。
4 仪器4.1气相色谱仪：附氢火焰（FID）检测器4.2数据处理机或积分仪4.3分析天平：万分之一4.4超声清洗机4.5离心机：3000r/min5分析方法5.1试样提取5.1.1固体试样：称取试样适量（相当于含大蒜素5mg，精确至0.001g），加无水乙醇适量，密塞，超声70min，取出冷却，加正己烷定容（调节大蒜素含量约为1mg/mL），振摇，静置分层后，取上层溶液进样。
5.1.2液体试样吸取试样适量（相当于含大蒜素5mg，精确至0.001g），置于分液漏斗中，加5mL 正己烷振摇提取1min ，静置（或离心）分层后，取上层溶液进样。
5.2 气相色谱参考条件5.2.1 色谱柱：HP-5(30m×0.25mm)5.2.2 柱箱温度：100℃（3min ）min)10(℃200℃150℃/min 20℃/min 10−−−→−−−−→−5.2.3 进样口温度：220℃ 5.2.4 检测器温度：250℃ 5.2.5 载气：氮气（1mL/min ）5.2.6 氢气：40mL/min ；空气：400mL/min 5.2.7 进样量：1μL5.3 定性分析：在参考操作条件下，以对照品与试样比较保留时间定性。
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大蒜素粉微生物限度检查方法验证魏鸿雁1*，谢志军2，贾晓光1*（1新疆中药民族药研究所乌鲁木齐 830002， 2国药集团新疆制药有限公司乌鲁木齐 830032）[摘要] 目的：建立冻干蒜粉的微生物限度检查方法。
方法：采用《中国药典》2010年版收载的微生物限度检查方法的薄膜过滤法、离心集菌法进行验证。
结果：大蒜素粉对细菌和真菌均有很强的抑制作用，为了消除药物抑菌活性对实验结果的干扰，可采用薄膜过滤法进行细菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，采用离心集菌法进行大肠埃希菌的检查。
结论：大蒜素粉具有抑制活性，须采用特殊方法消除药品的抑菌活性才能检测样品中微生物的真实含量。
[关键词] 大蒜素粉；微生物限度检查；验证；薄膜过滤法Verification of Methodology on the Microbial Limit Test for Alltride powderWEI Hong-yan1, XIE Zhi-jun2, JIA Xiao-guang1*(1.Xinjiang Institute of TCM and National Drugs,Urumqi 830002,China;2 Sinopharm Group Xinjiang Pharmaceutical CO.,LTD. Urumqi 830032,China.)[Key words]:Alltride powder; Microbial Limit Test; Verification of Methodology; Membrane filtration method.大蒜素粉为百合科植物大蒜Allium Sativum L.鳞茎的冷冻干燥粉末，通常称作冻干蒜粉，是一种生物活性药食两用制品，完全保留鲜蒜全部有效成分。
本品对多种球菌、百日咳杆菌、白喉杆菌、痢疾杆菌、伤寒及副伤寒杆菌、大肠杆菌、结核杆菌等有抑制和杀菌作用。
对真菌感染有抑制作用。
对阿米巴原虫、阴道滴虫、蛲虫等也有抑制和杀灭作用。
主要功能为解毒、杀虫、止痢[1] [2] [3]。
由于大蒜素粉有杀菌抑菌作用，对微生物的生长有干扰[1]，按常规方法测定其微生物限度无法保证其准确性，必须选择合适的方法消除其供试液的抑菌活性后，再基金项目：国家支撑计划项目“维吾尔医药的现代化研究与产业化示范”（2007BAI30B03）作者简介：魏鸿雁（1969-）,女,副研究员，全国执业药师。
从事中药民族药研发工作。
Tel：(0991)2662160 E-mail：whywlmq@通讯作者简介：贾晓光（1954-）,男,研究员。
从事中药民族药研究工作。
Tel：(0991)2633141。
依法检查，才能检测出大蒜素粉中的真实含菌量[4]。
本实验采用薄膜过滤法进行细菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，采用离心集菌法进行大肠埃希菌的检查，为确保检验方法的准确性和可靠性，对以上方法进行了计数方法及检查方法的验证。
1 实验材料1.1 器材薄膜过滤器(海宁市亚泰制药机械有限公司)；LDZX-40立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；LRH-250生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；SHH-250JS 霉菌培养箱(重庆万达公司公司)；SW-CJ-1B型标准净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）； HTY-761型匀浆仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)等。
1.2菌种大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕；金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕；枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕；白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕；黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕均购于新疆维吾尔自治区食品药品检验所。
1.3 培养基及稀释剂营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、胆盐乳糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基，以上培养基均由北京三药科技开发公司提供；含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液、0.9%灭菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等为新配。
1.4 供试品大蒜素粉（新疆天和保健品有限公司生产，批号为0904097）2 实验方法与结果[4] [5]2.1 试验菌株菌悬液的制备2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物接种至营养肉汤培养基，30～35℃培养18～24h,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml的菌悬液。
2.1.2 白色念珠菌菌悬液取白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁培养基，23～28℃培养24～48h。
用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml的菌悬液。
2.1.3 黑曲霉菌菌悬液取黑曲霉菌新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，23～28℃培养5～7d。
用含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液8ml，将孢子洗脱至无菌试管中，用含0.05%聚三梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释成含菌数为50～100cfu/ml 的孢子悬液。
2.1.4 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
2.2 供试液的制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,匀浆仪2000r/min混合30s，制备成1:10的供试液。
2.3 细菌总数、霉菌及酵母菌总数检查方法的验证2.3.1 试验组平皿法与培养基稀释法分别取各稀释倍数的供试液1ml各注入两个平皿，加入50～100cfu试验菌，立即注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，做菌落计数。
2.3.1.1 平皿法：取供试液1ml/皿，分别污染上述5种代表试验菌株，再加15～20ml 规定的培养基，凝固后置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。
2.3.1.2 培养基稀释法：取供试液0.2 ml/皿，0.1ml/皿，分别污染50～100cfu/ml 试验菌株，再加15～20ml规定的培养基，凝固后置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。
2.3.1.3 薄膜过滤法：取供试液1 ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml 混匀，过滤。
每支滤筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗，共3次。
冲洗后取出滤膜，贴膜测定。
阳性对照在最后一次冲洗时分别污染50～100cfu/ml试验菌株，置规定温度培养24～72h，观察、计数、测定回收率。
2.3.2 菌液组另取两个平皿，不加供试品，分别加入50～100cfu试验菌，平行两个平皿，立即注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，做菌落计数。
2.3.3 供试品对照组取相应稀释级试验组等量的供试品至培养皿中，平行制备两个平皿，不加菌液，注入45℃溶化的相应培养基15～20ml，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定时间，测定供试品本底菌数。
2.3.4 验证试验至少进行3次独立平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。
2.3.5 菌回收率的计算试验组菌的回收率（%）= 试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数×100% 菌液组的平均菌落数2.3.4 结果表1 污染菌回收率金铺球菌% 枯草芽孢杆菌% 大肠埃希菌% 白色念珠菌% 黑曲霉菌% 1ml/皿0 0 0 0 0 0.2ml/皿0 0 0 0 0 0.1ml/皿0 28 69 0 0薄膜过滤法91 90 92 89 92 采用平皿法与与培养基稀释法(5倍稀释)，5种污染菌回收率为0，说明供试液与5倍稀释供试液对对照菌有明显抑制。
采用培养基稀释法(10倍稀释)时，枯草芽孢杆菌回收率均在28%，大肠埃希菌回收率均为69%，其余污染菌回收率为0，说明10倍稀释供试液对枯草芽孢杆菌与大肠埃希菌有微量抑制，对其余菌株有明显抑制。
采用薄膜过滤法时，五种污染菌回收率均在70%以上，说明此法可消除供试液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的抑菌性。
2.4 大肠埃希菌检查方法验证取供试液10ml，分别加至100、500 ml BL增菌液中，另取取供试液10ml500r/min 离心5min，取上清液3000r/min离心5min，取下层液约2ml，加至100 ml BL增菌液中，30～35℃培养18～24h。
取上述增菌液0.2ml，加入5ml4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基试管中，30～35℃培养5～24h，观察荧光，再加入靛基质试剂观察结果，同时做阴性对照。
结果如下：BL液中BL液中加至100 ml BL液中试验组混浊混浊混浊对照组微混微混微混MUG试验试验组与对照组均阴性试验组与对照组均阴性试验组阳性，对照组阴性靛基质试验试验组与对照组均阴性试验组与对照组均阴性试验组阳性，对照组阴性以上结果表明，离心集菌法排除了样品的抑菌干扰，可作为大蒜素粉的大肠埃希菌检查方法。
3.讨论本实验研究说明大蒜素粉对细菌和真菌均有很强的抑制作用，对于这种具有较强抑菌活性的药物，在进行微生物限度检查时，应消除其抑菌活性，才能检测出样品中的真实含菌量。
薄膜过滤能使微生物充分被滤膜截留，再用无干扰的冲洗液冲洗，消除供试品的干扰，就能准确检测样品中的微生物。
冲洗液的用量也很关键，用量过大会损坏菌体，影响回收率，还会破坏滤膜，影响试验结果；用量过小，冲洗不充分，不能消除样品的干扰，也无法保证实验的准确性。
大蒜素粉的微生物限度检查方法可采用薄膜过滤法进行细菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查，实验条件为取1:10供试液1ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中混匀，过滤，每只滤筒用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml冲洗，共三次，贴膜测定；采用离心集菌法进行大肠埃希菌的检查，实验条件为取1:10供试液10ml，500r/min离心5min，取上清液3000r/min离心5min，取下层液约2ml依法检查。
参考文献[1] 新疆中草药.新疆人民卫生出版社（K）.1975:279-280.[2] 维吾尔药卷/国家中医药管理局《中华草本》编委会编著.中华草本[M].上海科学技术出版社.2005,12:63-65.[3] 国家药品标准,化学药品地标升国标国家药品标准第一册[S].国家食品药品监督管理局.WS-10001-(HD-0052)-2002.[4] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典二部[S].中国医药科技出版社.2010,1.附录107-116.[5] 中国药品生物制品检定所编.中国药品检验标准操作规范[S].中国医药科技出版社.2005,6:325-372.。