包涵体
包涵体的形成以及处理方法
包涵体得形成以及处理方法1包涵体形成得原因(1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体L２]。
原因可能就是合成速度太快,以至于没有足够得时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间得非特异性结合,蛋白质无法达到足够得溶解度等。
(2)重组蛋白就是大肠杆菌得异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。
(3)重组蛋白分泌序列得存在阻碍折叠,导致错误折叠分子得产生。
(４)重组蛋白得氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
(５)包涵体形成动力学研究表明,包涵体就是由部分变性得中阃体聚合而成。
因此,任何影响中间体稳定得因素,如pH值(ｐＨ接近蛋白得等电点时容易形成包涵体)离子强度与温度都可以引起蛋白聚合反应。
(6)在细菌分泌得某个阶段,蛋白质分子间得离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体得形成、(７)有报道认为,丰富得培养基有利于活性蛋白质得表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体？。
包涵体得处理包涵体得形成具有有利得一面,也有不利得一面、有利得一面就是包涵体得形成去除了几乎全部得细胞内可溶性蛋白质。
同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物得降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白得１0％～30％,甚至高达５0％。
不利得一面就是溶解包涵体进行复性折叠得过程中需要加变性剂与去垢剂,而引起蛋白质得不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性得操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解与沉淀,有些还形成异构体【s] ５。
因此复性就是蛋白质工程中最关键、最复杂得问题。
包涵体得处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌得过程中目得蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适得缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加入保护剂,如还原剂DTT(２一巯基苏糖醇)、２一巯基乙醇;加防止水解酶作用得试剂,如酶得抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
包涵体
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/ 毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体、多角体、噬菌斑、空斑、枯斑比较
包涵体、多角体、噬菌斑、空斑、枯斑的异同
∙在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
∙多角体polyhedra 是指随着某种昆虫病毒的感染，核内或细胞质中形成直径0.5-10微米的多面体，由晶状排列的碱溶性蛋白质组成，中间包藏着数目不定的病毒粒子。
它的功能是保护病毒颗粒免受外界各种不良环境的破坏，它对各种蛋白分解酶有抗性，而在碱中易溶解，释出病毒粒子。
∙噬菌斑，即噬菌体侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡·因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑，或称负菌落。
∙空斑( lacuna)在将产生大肠杆菌素的细菌和对该种大肠杆菌素敏感的指示菌与软琼脂混合涂在琼脂面上培养时，即可见到单个细胞产生的大肠杆菌素对指示菌起生长抑制作用的小形抑制斑，这就是空斑。
∙植物病毒侵染敏感植物叶片，被感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑，或称枯斑。
相同点：
1.前两者都是微生物抵抗外界形成的休眠体
2.后三者都是病毒引起的肉眼可见的现象
不同点：
1.包涵体是大肠杆菌休眠体，多角体是病毒休眠体
2.噬菌斑是细菌死亡的斑，空斑是细菌抑制细菌生长的斑，枯斑是植物坏死部分。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
什么是包涵体
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
基因工程包涵体的纯化方法
基因工程包涵体的纯化方法基因工程可真是个神奇的领域，像是现代科技的魔法师，把DNA这个小家伙们玩弄得团团转。
在这片神秘的土地上，包涵体就像是隐藏的宝藏，得先把它们找出来，再通过纯化的方法把这些小宝贝洗净，才能让它们为我们所用。
今天，我们就来聊聊基因工程包涵体的纯化方法，让这趟旅程轻松愉快。
1. 什么是包涵体？首先，包涵体可不是某种古怪的生物，它们其实是细胞在生产某些蛋白质时，形成的一种颗粒。
就像是做饭时，锅里油烟聚集的那些小油滴，虽然它们看起来不太好，但里面可藏着好东西。
你要知道，包涵体里面有大量的目标蛋白质，但通常它们会和其他杂质混在一起，像是大海捞针，得费点功夫才能捞出来。
1.1 包涵体的形成当细胞用上基因工程的技术，强行让某种蛋白质“上班”时，有时候它们就会不太乖，聚集成包涵体。
这就像你在做作业时，有的题目就特别难，结果一堆答案写错了，最后只好把它们堆到一边。
虽然包涵体一开始可能看起来像个废物，但其实它们是生产特定蛋白质的一种“副产品”。
1.2 包涵体的用途那包涵体有什么用呢？别小看了它们，它们可是制药、疫苗开发的重要角色。
有的包涵体能转化为活跃的蛋白质，成为我们需要的药物，甚至可以用于研究新治疗方法，简直就是科研界的“黑马”。
所以，找到它们、纯化它们，那可是相当重要的任务。
2. 包涵体的纯化步骤接下来，我们就要聊聊如何把这些包涵体给纯化出来，步骤其实不复杂，但得有点耐心。
2.1 细胞裂解首先，得把细胞给撬开，就像剥开一个鸡蛋，才能见到里面的蛋黄。
这里我们通常会用一些裂解缓冲液，像是加盐的水，帮助细胞膜变得松软。
然后，咱们可以用超声波处理、化学试剂或者冷冻融化的方式把细胞打散，让包涵体慢慢浮出来。
2.2 离心分离一旦细胞裂解，包涵体就会在液体中游荡。
这时候，就要用离心机来大显身手了。
离心机就像是一位厨师，用强大的“旋转功力”把细胞残骸和包涵体分开。
你可以想象，把一大锅汤放进离心机，旋转后，沉淀物就会在底下，清汤会在上面。
包涵体
包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子包涵体，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。
组成与特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、包涵体RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白沙眼衣原体包涵体间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体名词解释微生物学
包涵体名词解释微生物学
包涵体（inclusion body）是一类细胞内含有某种物质和/或颗粒的结构。
在微生物
学中，包涵体往往指细菌、病毒和真菌等微生物细胞内的结构。
通常，它们由蛋白质、核酸、多糖、脂质或晶体等物质组成，并可能参与微生物的代谢、能量存储、病原体感染等过程。
包涵体的形态、大小、数量和成分取决于不同的微生物种类和生长条件。
在细菌中，一些包涵体可以被视为副生代谢产物，如储存多聚糖、甘油、酯类和其他碳水化合物的类囊体，以及用于自我保护和存储重金属、镉、铜等重金属的金属沉淀体。
在病毒中，包涵体可以是病毒颗粒的结晶形态，或病毒的复制和组装产物。
包涵体在微生物的识别、分类和鉴定中具有重要的意义。
例如，微生物学家通过观察不同种类细菌和病毒中包涵体的位置、形状和成分等特征，可以判断它们的物种、亚型、毒性和恶性，从而为微生物病理学和抗感染药物研制提供依据和线索。
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
包涵体的形成
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
包涵体
Chart
包涵体的应用
包涵体不但具有易纯化、纯度高等特点，而且它多孔的疏松结构易于固定在固相介质上， 可重复使用，目前已在固定化酶领域得到广泛应用，如固定化氧化酶、激酶、醛缩酶等。 包涵体直径一般在 50nm ～ 500nm，是纳微技术研究的最好材料。 不溶性的颗粒状特点使它们适合作为生物材料广泛应用在组织工程、再生医学等生物医 学领域。如Mirjana liovic 等指出功能性包涵体可形成多聚体细胞骨架蛋白，特别是在上 皮细胞中，这在皮肤医学和美容医学上表现出极大的应用前景。 包涵体的研究对构象类疾病的研究有重大指示意义，有利于新药的研发和新治疗方案的 设计。如到目前已经发现有15～20种蛋白质能形成淀粉样沉淀,与人的纹状体脊髓变性病 (Creutzfeld-Jakob Disease,CID)、老年痴呆症(Alzhemer)、帕金森氏病(Parkingson)、 淀粉样蛋白病(systemic amyloidoses)和神经变性疾病等病的研究有重要意义。
尿素(6~8mol/L)或盐酸胍 (4~6mol/L)对蛋白质的氢键有较强的可逆性变性 作用,可破坏蛋白质高级结构,或伸展肽链分子之间的相互作用, 使其去折叠。包 涵体溶解还可添加去污剂如 SDS, CTAB, Tween 20, NP40,T ritionX-100, Sarkosyl(月桂酰 -N-甲基氨基乙酸钠 )、还原剂DTT、DTE、GSH、B-巯基乙 醇, 还原剂可以过量, 以保证半胱氨酸还原完全。螯合剂EDTA, EGTA也被用来 阻止金属离子催化的空气氧化反应, 硫化物的形成或二硫化物混和物也可保护 被还原的半胱氨酸。或在极端 pH、高温条件下进行。
包涵体
与生物分离技术
目录
CONTENTS
包涵体 简介
包涵体名词解释
包涵体名词解释包涵体（inclusive entity）是指在现象或概念中包含其他实体或元素的整体或集合。
包涵体可以是一个物体、一个系统、一个概念或一个集合，它包含了多个组成部分或成员。
这些成员可以是物质实体、观念、特征、属性、关系等。
包涵体的概念源于哲学和逻辑学的领域，用于描述一个整体或集合与它的组成部分之间的关系。
它强调了整体和部分之间的内在联系和相互依赖关系。
包涵体的概念在不同领域也有不同的应用和解释。
在自然科学领域，包涵体可以指一个物体或系统，例如一个生物体或一个生态系统。
生物体可以包含细胞、器官、组织等组成部分，而生态系统包括了不同的物种、种群、生态位等生物要素。
在社会科学领域，包涵体可以指一个社会组织、一个社会系统或一个社会概念。
例如一个国家可以被看作是一个包涵体，它包括了政府机构、民众、经济等多个组成部分。
同样，家庭、组织、企业等也可以被视为包涵体。
在心理学和认知科学领域，包涵体可以指一个概念或一个思维结构。
例如概念“动物”可以被视为一个包涵体，它包含了不同种类的动物，如狗、猫、鸟等。
同样，思维结构“家庭”也可以被看作是一个包涵体，它包含了成员之间的关系、角色等。
在数学和逻辑学领域，包涵体可以指一个集合或概念的范畴。
例如集合A包含了元素a、b、c等，可以表示为A={a, b, c}，其中a、b、c是集合A的成员。
包涵体也可以指一个概念的定义和范围，如概念“动物”包含了各种不同的物种。
总之，包涵体是一个广义的概念，可以用于描述不同领域中的整体和部分之间的关系。
它强调了整体和部分之间的相互联系和相互作用，是理解和解释现象和概念的重要概念之一。
关于包涵体-蛋白表达时的双刃剑
关于包涵体-蛋白表达时的双刃剑一、包涵体是指细菌表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成无活性、不溶性的固体颗粒。
包涵体的存在常使得细胞破碎后很浑浊。
包涵体中一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等.二、包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
三、包涵体表达的有利因素1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
四、包涵体的复性过程包涵体的复性过程主要包括分离、洗涤、溶解、复性等过程。
1、分离：（1）离心：5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
（2）过滤或萃取方法2、洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。
包涵体的形成以及处理方法
包涵体的形成以及处理方法包涵是一种人际关系的方式，指的是接受和容忍他人的缺点和错误，并以宽容和理解的态度对待他们。
包涵体的形成受到个人成长、教育背景和文化环境的影响。
处理方法包括培养同理心、控制情绪、积极沟通、设定清晰的界限等。
首先，个人的成长经历和教育背景对形成包涵体起到重要的作用。
在家庭和学校的教育环境中，如果得到充分的关爱、尊重和理解，个人更容易具备包容他人的心态。
与此相反，如果经历了严厉的批评和惩罚，可能会增加攻击性和不包容的倾向。
因此，良好的家庭关系和积极的教育体验有助于培养包容他人的能力。
其次，文化环境对包涵体的形成也具有重要影响。
不同文化对包容他人的态度有所差异。
一些文化强调个人自由和自主性，倾向于对他人的错误持批评的态度。
而另一些文化则注重集体利益和和谐关系，更倾向于包容他人。
因此，个体所处的文化环境将影响到他们对他人错误的回应方式。
在处理包容他人的挑战时，有几种方法是值得我们运用的。
首先，培养同理心是关键。
通过设身处地地想象自己处于对方的位置，我们能够更好地理解他人的行为和动机。
这样，我们就能用宽容和理解的态度对待他们的错误和缺点。
与此同时，我们也要学会控制情绪，避免过度反应或过度批评他人。
情绪的控制有助于我们更理性地对待问题，并提供合适的回应。
积极沟通也是处理包容他人的重要方法之一、通过与他人积极沟通，我们可以更好地理解彼此的需求和意愿，从而减少误解和冲突。
我们可以表达自己的需求和意见，同时尊重他人的立场和意见。
通过开放和包容的对话，我们能够建立和谐和理解的关系。
此外，设定清晰的界限也对处理包容他人的问题至关重要。
我们需要明确告知他人我们的底线和原则。
如果他人的行为严重违背我们的底线，我们可以采取适当的措施，如避免与其交往或限制与其的接触。
设定清晰的界限可以维护自身的权益和尊严，并防止他人过度侵犯。
综上所述，包涵体的形成受到个人成长、教育背景和文化环境的影响。
处理包容他人的挑战可以通过培养同理心、控制情绪、积极沟通和设定清晰的界限来达成。
包涵体简介
4、复性
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性 或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。
1、盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下 是有效的促进剂。 2、分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅 氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调 节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白 质的折叠复性。
4、复性
3、超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过而 截留蛋白质。
优缺点：在生产中较多使用，规模较大，易于对透析速度进行控制。但不适 合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。
4、色谱复性：是最近研究较多并成功地在生产中应用的一种 复性方法，常用于复性的层析方法有疏水层析(HIC)法、亲和 层析(AFC)法等 。 凝胶过滤复性：蛋白质仅在胶粒中传质和扩散外，与介质之 间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用， 并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白 质的复性有利。 吸附型层析复性：层析柱平衡后，可将变性蛋白上样并吸附 在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂 蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过 程中完成复性。
5、溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。 在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃ 保温10 min，或者室温作用30 min。
2、洗涤包涵体
常用洗涤试剂：中性去垢剂和还原剂。 在包涵体表面吸附着大量的不溶性蛋白，通过包涵体的洗涤 能够除去一些影响重组蛋白活性的杂蛋白。例如，大肠杆菌 外膜蛋白OmpT在8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶的活性，可 能在包涵体的溶解中降解重组蛋白（但过高浓度的尿素或盐 酸胍会使包涵体溶解）。
包涵体的形成以及处理方法
包涵体的形成以及处理方法1 包涵体形成的原因(1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成]。
(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。
(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。
因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。
(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。
包涵体的处理包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。
有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。
同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50％。
不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体【s] 5。
因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。
包涵体的处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞提取包涵体时，首先要裂解细菌，为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加入保护剂，如还原剂DTT(2一巯基苏糖醇)、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
包涵体用途
包涵体用途包涵体是一种被广泛用于工业、建筑和家居领域的保温材料。
它由气泡聚脂薄膜和镀铝箔等材料组成，具有优异的防潮、防火、保温和隔音功能。
包涵体的用途非常广泛，可以在不同的场合中发挥其独特的优势。
首先，包涵体在工业领域起到了重要作用。
在许多工业设备和机器中，需要使用保温材料来保护设备不受外界环境的影响，同时也可以提高设备的工作效率。
包涵体因其轻便、易于安装和优异的保温性能而成为理想的选择。
例如，包涵体可以被应用于石油和化工行业的油罐、管道和容器等设备上，用来保持油品的温度、减少能量浪费和防止火灾事故的发生。
其次，包涵体在建筑领域也有重要的应用。
建筑物的保温是一项关键的工作，可以有效地降低能源消耗，改善室内环境质量，提高居住和工作的舒适性。
包涵体可以在屋顶、墙壁、地板和门窗等部位使用，形成一个具有隔热和防潮功能的保温层。
此外，包涵体还可以用于一些特殊场所，如冷库、热泵和太阳能电池板等，提供更好的热量保护和能源效率。
另外，包涵体也被广泛应用于家居领域。
在现代生活中，人们越来越注重居住环境的舒适度和能源消耗的减少，因此需要一些有效的保温材料来满足这些需求。
包涵体能够在家庭中用于隔热、防潮和隔音，例如，可以安装在房屋的天花板、墙壁和地板下，起到保温、阻挡噪音和减少湿气的作用。
此外，包涵体还可以用于制作保温箱、保温袋和冷热包等产品，用于保持食物和饮料的温度，并在户外活动时提供热量的保护。
总之，包涵体是一种多功能的保温材料，广泛应用于工业、建筑和家居领域。
它的优异性能和易用性使其成为人们在保温工程中的首选材料。
在不同的应用场合中，包涵体都能发挥其独特的保温、隔音和防潮功能，提供更加舒适和安全的居住和工作环境。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
5、以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白， 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
.
四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解
1 、破菌 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：
机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量 传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞 悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再 结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度 和回收率。
Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，
而以可溶形式出现。
6 、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子
键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
.
三、包涵体表达的有利/有害因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包 涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提 高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速 离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与 细胞膜碎片分离。
.
2 、分离 5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉
淀，与可溶性蛋白分离。
.
3 、洗涤 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成
分，如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。由于这 些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一 起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度 的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加 EDTA和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等， 因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤 包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至 少可达50%以上，而且可保持原结构。
.
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂 /EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部 分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理 条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。 EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、 脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤 去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜 蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋 白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中 可导致重组蛋白质的降解。
胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由
于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因
子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积
累，容易形成包涵体沉淀。
.
5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH
的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较
关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和
.
二、包涵体形成的原因
包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过
程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，
无法形成正确的次级键等原因形成的。具体的原因可
能有以下几点：
.
1 、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常
的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱
和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少
形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能
是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二
硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫
氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明
显与包涵体的形成呈正相关。
3 、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或
包涵体的纯化
.
一、包涵体的定义
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成 无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白， 其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白 ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA， 以及脂体、脂多糖等。
大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml）， 无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍 等。
.
用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、 超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变 清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声 波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀 浆 ，反复冻融法 ，化学处理法 。
.
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋 白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解， 导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP） 可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活 性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰 氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全 部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过 选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于 目的物质的提取。
.
实验室用的是低浓度的变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。
.
4 、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级 结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的 二硫键和次级键 。
.
变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其 分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级 结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结 果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重 金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物 理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。 重金属盐 使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中 游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键 的断裂和生成，因此是一个化学变化。