什么是包涵体

包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。

包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。

多为圆形、卵圆形或不定形。

一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。

包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。

多为圆形、卵圆形或不定形。

一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。

有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。

有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。

特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。

这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。

自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。

Georgiou等人发现天然的蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，如内酰氨酶和碱性磷酸酶的过量表达，都形成了包涵体，前者的包涵体在外周质，后者的包涵体存在于细胞质中。

其它的宿主细胞中也发现了重组蛋白质过量表达时形成的包涵体或者聚集体，如细菌病毒、哺乳动物细胞中。

包涵体在一些外界压力下也可以形成，如温度，是影响包涵体形成与否的主要因素。

有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体，这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。

所以有人认为，当蛋白质具有高的融化温度、高的天然构象稳定性的情况下，包涵体就不容易形成。

但是，对一些体内包涵体形成的研究发现，包涵体的形成先于成熟肽链的形成，或者是同时进行的。

在研究P22尾刺蛋白质发现，尽管尾刺蛋白质有高的稳定性，结构中主要是片断，融化的温度是88℃，并不受SDS、蛋白质酶和热失活的作用，但是这种蛋白质是为数不多的在细胞内形成包涵体的原核蛋白质模型。

有些天然的蛋白质在高温（39.1℃）表达时可以提高25%，但是这些蛋白质不能折叠成天然的状态而形成聚集体。

聚集体形成的动力学表明，这些聚集体是从部分折叠的中间体形成的。

实际上，这些折叠的中间体或者形成天然的状态，或者形成聚集体，这个过程是温度依赖性的，温度的升高利于聚集体的形成。

当蛋白质肽链在高温下表达，合成的肽链足够早地转移到低温下时，这些蛋白质肽链会重新进入折叠的过程。

同时，当尾刺蛋白质在允许的温度下表达后，再把细胞转移到高温下，这些蛋白质肽链保持活性，证明了一旦蛋白质被正确的表达并折叠成正确的构象以后，则细胞内的蛋白质的稳定性和溶解性在高温下不再改变。

蛋白质在体内折叠的中间体对于温度因子明显敏感。

沙眼衣原体包涵体认为较高的温度可能增加了蛋白质合成的速度、折叠中间体形成聚集体的速度以及疏水相互作用力，表达的蛋白质易于以包涵体的形式存在。

其它的发酵条件同样影响蛋白质包涵体的形成，发酵液中加入蔗糖可以大大降低内酰胺酶包涵体的形成。

蔗糖的作用可能是稳定天然蛋白质的结构或者防止蛋白质折叠中间体的聚集。

在体外的内酰胺酶折叠复性的过程中，同样发现复性缓冲液中加入蔗糖可以提高蛋白质的复性率。

其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白质的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。

也有报道认为在丰富的培养基中有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体。

蛋白质的聚集体和包涵体不仅仅存在于重组蛋白质的表达中，是一个广泛存在的现象。

通常认为，蛋白质的聚集现象，无论细胞内还是细胞外，都是中间体不能完成折叠而形成自我聚集现象。

包涵体的形成与多肽链的序列、表达速度、可用的伴侣分子的量以及生长的环境有关。

特点包涵体是新合成的肽链在折叠过程中部分折叠的中间体形成的，而不是由完全的解折叠形式的蛋白质形成的，这可能与体外复性时聚集体的形成有相似的机制，应该考虑到在包涵体中含有这些部分折叠的结构。

但是，由于包涵体的特性，很难利用物理的方法去探测包涵体中蛋白质肽链的结构。

Zetlmeissl等人利用圆二色的方法，发现聚集体的肽链保持了部分的二级结构。

利用Raman测定的方法也得出了相同的结论。

利用ATR-FTIR发现包涵体蛋白质的结构比天然的蛋白质和盐沉淀的蛋白质含有更多的非天然状态的折叠的结构。

Murry等人利用免疫学的方法测定色氨酸合成酶的亚基，蛋白质复性以后，出现三种形式的蛋白质：一种是不溶的高分子量的聚集体，一种是可溶的复性完全的蛋白质，一种是可溶的低分子量的聚集体，最后一种聚集体同天然的蛋白质一样有免疫活性，可以与两种单克隆抗体结合，但是天然蛋白质的另外三种抗体不与它结合，说明了即使没有复性，聚集体仍保持了部分的近似天然的结构状态。

在大肠杆菌中，包涵体可以在细胞的两个位置出现：细胞质和外周胞质。

包涵体在细胞内形成的位置和特点取决于蛋白质表达的方式。

三种表达的内酰氨酶，一种是天然的内酰氨酶，一种是含有OmpA信号肽，一种完全切除了天然蛋白质的信号肽，当大量表达时，造成了聚集体的形成，前两者的聚集体在外周胞质，后者在细胞质内形成聚集。

这些包涵体在大小和形状有相当清楚的差别，这些差别表现了聚集体的表面形态、组成和形成聚集体的多肽链构象上的不同。

大肠杆菌细胞质中的包涵体直径一般在0.2到1.5μm之间，不同的蛋白质具有不同的直径，如干扰素的大小是0.811μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。

大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。

在一些情况下，有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠杆菌有一个突起。

一般情况下，一个细胞仅有一个包涵体。

包涵体从来不吸附在膜上，并且不同于真核细胞中的其它的细胞器。

高精度的投射电子显微镜显示了多孔的结构。

所有的包涵体密度较大，是微生物细胞中密度最大的结构，密度在1.1-1.3之间，不同蛋白质的包涵体的密度也不同，一些低分子量的包涵体结构是多孔的。

聚集体的构象还没有进行系统的研究，但是已经知道聚集在一起的作用力不是共价键，主要的是疏水相互作用力。

大肠杆菌的细胞质中有大量的谷胱甘肽，抑制二硫键的形成。

所以，当蛋白质在细胞质中表达时，由于形成不了二硫键而形成了聚集体。

内酰氨酶的包涵体进行蔗糖梯度离心表明其中95%是蛋白质成分，说明很少有其他的蛋白质成分加入到聚集体中，利用免疫学的方法，也没有发现伴侣分子。

体内聚集体的形成不仅产生包涵体，而且会带来淀粉质的疾病，对哺乳动物同样会造成疾病。

对体内或者体外蛋白质聚集体形成的研究，特别是了解氨基酸序列如何避免聚集体的形成，可以大大提高蛋白质在体外折叠的收率，并且有助于理解体内分子病形成的机制。

病毒包涵体包涵体有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体）。

有的包涵体还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Vegri）小体。

分离一旦一个稳定的、重复的发酵过程建立起来，则要考虑提取包涵体的步骤了。

包涵体处在细胞质内或者细胞的外周质，必须破坏细胞膜才能把包涵体释放出来。

溶液中的包涵体也要同破碎液中溶解的成分和不溶的其它成分如细胞碎片、细胞膜以及核糖体等成分分离开来。

提取的第一步是冷却发酵液，利用离心或者错流过滤的方法收集细胞，细胞的沉淀利用设定的含有一定浓度的离子强度（0.4-0.6mo1）的缓冲液悬浮。

这种缓冲液必须控制pH、离子强度、重金属的浓度和氧化还原的环境，在以后的操作步骤中也要考虑这些因素。

由于包涵体比细胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎细胞的方法有很多。

对于大肠杆菌，最经常使用的方法是高压匀浆的方法，可以使细胞完全破碎，并且这种方法可以以不同的规模使用，2到5个循环可以使细胞完全破碎。

酵母细胞由于含有更加有弹力的细胞壁，所以需要的循环可能更多，或者在容器中加入一些玻璃颗粒。

破碎细胞还可以使用物理的方法如超声，或者化学的方法如化学试剂和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）来破碎细胞。

包涵体可以使用过滤或者离心的方法，把细胞破碎液中的其它成分除去，这两种方法利用了包涵体的不同物理特性。

由于包涵体和可溶蛋白质的体积不同，所以可以使用过滤的方法，这种方法可以降低操作成本，易于放大。

一些实验已经证明过滤的方法是分离包涵体的有效的手段，但是这种方法也存在着一些缺点：过滤膜很容易被一些不透过的成分所堵塞，即使使用错流过滤或者使用很高的流速，这种情况都不能避免。

并且，由于微孔膜是根据成分的大小来分离的，一些细胞碎片也容易与包涵体混在一起。

而包涵体蛋白质的密度比相同体积的细胞碎片的密度大得多，所以使用离心的手段可以把包涵体与细胞的其它成分分离开来。

如果细胞碎片没有同包涵体分离，在以后的分离手段中必须把膜上的组分分离开来。

有时，有些目标蛋白质以溶解的形式存在，可以通过在细胞破碎以前加入一些非极性的物质（如苯酚、甲苯）或者去垢剂，通过这个方法可以提高从大肠杆菌表达的人生长激素包涵体的收率。