包涵体复性(课堂参照)
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
蛋白质、包涵体复性
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体蛋白质复性纯化ppt课件
从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当 溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它 辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致 蛋白质的自发复性效率极低。
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3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的 使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情 况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性 （蛋白聚集于膜上）。
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↓ 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body)
↓ 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)
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复性目的
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复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中 间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展 状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除 还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。 对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时 复性过程已经结束。
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包涵体复性
包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。
2.破碎，离心，收集沉淀。
加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。
在冰上进行，可放在摇床上。
3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。
4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。
5.结合液冲洗柱子。
6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。
8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。
再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。
重组蛋白基础知识介绍
一，重组蛋白分类：
1，上清：His上清，His-Sumo上清，GST上清,
2，包涵体复性：His包涵体复性，GST包涵体复性
3，包涵体：His包涵体，GST包涵体
二，重组蛋白缓冲体系：
1，His上清NTA-0+500mM咪唑
2，His-Sumo上清NTA-0+500mM咪唑
3，GST上清1*PBS（包含10mMGST）
4，His 包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
5，GST包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
6，His包涵体6M盐酸胍，8M尿素,
7，GST包涵体6M盐酸胍，8M尿素
三，各种稀释液配方：
TE缓冲液（10mM Tris 5mM EDTA）
NTA-0 ( Tris,NaCl ,10% 甘油)
四，基础知识介绍：
1，His上清与His-Sumo上清的区别：
His上清是用pET28a载体表达的上清蛋白，上面只有一个His标签，His-Sumo上清是pET28a-Sumo载体表达的上清蛋白，Sumo蛋白上面有His标签。
Sumo是一种分子伴侣，大约18KD，可以与小分子量的蛋白相连接，增加蛋白分子量，增加免疫原性。
2，乳化稀释液
一般来说是重组蛋白用哪种缓冲体系，乳化稀释液就用那种稀释液。
NTA-0可以换成1*PBS缓冲液，His包涵体或GST包涵体缓冲液是6M盐酸胍用3M盐酸胍稀释，His包涵体或GST包涵体缓冲液是8M尿素用4M尿素稀释。
影响包涵体复性的因素
影响包涵体复性的因素
包含体复性是指信息在不同的文本或媒体中传递和保持一致的程度。
影响包含体复性的因素有很多，以下是一些常见的因素：
1. 内容本身：信息的准确性、详细性和一致性会影响包含体复性。
如果内容存在错误、矛盾或缺乏细节，那么在不同的文本中传递时就会出现不一致。
2. 传播媒体：不同的媒体平台和渠道对信息的传达方式和格式有不同的限制和要求。
这可能导致信息在传播过程中的改变和失真，降低了包含体复性。
3. 翻译和转述：当信息从一种语言或媒体转换为另一种语言或媒体时，可能会出现误解、漏解或误传。
这会影响信息的一致性和包含体复性。
4. 个人观点和偏见：在信息传递过程中，个人的观点、态度和偏见可能会对信息的解释和表达产生影响。
这可能导致信息在不同文本中的差异。
5. 时间和环境因素：随着时间的推移和环境的变化，信息的背景和语境也可能发生变化。
这可能导致信息在不同文本中的表达和理解发生变化，降低了包含体复性。
综上所述，包含体复性受多种因素的影响，包括内容本身、传播媒体、翻译和转述、个人观点和偏见，以及时间和环境因素。
理解这些因素可以帮助我们更好地
识别和解决信息一致性的问题。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100,1mg/ml溶菌酶。
(溶菌酶在这个pH围比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的."取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体?"而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。
包涵体复性方法-李
1、上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）：
全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 含1% TritonX-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/mL Leupeptin 超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，150 mMNaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液平衡Ni-IDA 亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测；
2、包涵体通过亲和层析纯化蛋白
包涵体采用50 mM Tris (pH8.0)，150 mM NaCl 含1% Triton X-100，2 mM EDTA，2 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA 柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测。
3、经Ni-IDA 亲和层析纯化分析，收集纯度较高的梯度，将其加入到处理后的透析袋中，4 ℃环境下，透析到缓冲液［1×PBS(pH 7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，2 mM EDTA，0.4 M L-Arginine，1 M Urea，2 mM DTT］中复性（搅拌，换一次液，不加搅拌一晚上换2次，），复性后最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，20% Glycerol，2 mM DTT 溶液约6-8 h。
透析复性结束后，上清用0.22μm 滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
包涵体蛋白质的复性研究进展
功应用于 生产中的一种复 性方法 , 按 其作 用机 制一般 分成 分子排阻 复性、 介质吸附复性、 疏水色谱复性 3 类。 2. 1 分子排阻复性 分子 排阻复性主要是根据包涵体蛋白质与变 性剂之间 分子质量 大小的差异 , 利 用凝 胶柱使 得变 性剂 与包涵 体蛋 白质分离 从而得以复性。 介质的 分离 范围 和分离 度、 蛋白 质浓度、 进样体积、 蛋白质在 柱内的保留时间以及 凝胶柱的药物生 Nhomakorabea物
技
术
306
P harm aceut ical Biot echno logy
2007, 14( 4) : 306~ 309
包涵体蛋白质的复性研究进展
张婷婷, 叶波平
*
*
( 中国药科大学 生命科学与技术学院 , 江苏 南京 210009)
摘
要
外源基因在大肠杆菌中高效表达时 , 通常会形 成不溶 性、 无活性的 蛋白聚 集体
gu等人6利用尿素和ph梯度的凝胶过滤柱对单链抗体可变区scfv进行了复性与传统的分离方法相比具有高效和省时的优点其复性的原则是选择仅对包涵体蛋白全排阻的树脂预先引入从高到底的尿素梯度和从低到高的ph梯度在层析过程中变性的蛋白沿着尿素梯度向下移至复性缓冲液中为蛋白质提供了一个较温和的环境达到了线性去除变性剂减少聚集产生的目标
包涵 体。包涵
体中 富含表达的重组蛋白质 , 它们经分离、 洗涤、 变性溶解以及复性 等过程才能得到具有生物活性的 蛋白质。近 年来 , 随着对包涵体体外复性机制的深入研究 , 从包涵体中 复性重组蛋 白质已 经有了 很多的策 略和方 法。文章 就有关工作的进展进行了综述。 关键词 包涵体 ; 折叠 ; 蛋白复性 文献标识码 : A 文章编号 : 1005 8915( 2007) 04 0306 04 中图分类号 : Q 7
包涵体复性
包涵体复性
透析袋处理：
1、2%碳酸氢钠和1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮10min；
2、用蒸馏水彻底洗净；
3、放在1mmoL/L EDTA（pH8.0）中煮沸10min；
4、放在4℃，浸在ddH2O。
试剂配制
0.5M CAPS：称取CAPS 5.53g，溶于ddH2O，定容50mL；
30%十二烷基肌酸纳：称取3g十二烷基肌酸纳，溶于ddH2O，定容10mL；
0.5M Tris-HCl（pH8.5）：称取6.05g Tris，溶于ddH2O，盐酸滴定至pH8.5，定容100mL；
1M DTT：称取DTT
包涵体溶解液：0.5mL CAPS + 166uL 30%十二烷基肌酸纳+ 5uL DTT + 4.3mL ddH2O，共5mL；
包涵体透析液1：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5）+ 30uL DTT，加水至300mL。
包涵体透析液2：12mL 0.5M Tris-HCl（pH8.5），加水至300mL。
1、将bufferE洗脱的蛋白加入干净的透析袋里，4℃PBS透析过夜，期间换两次PBS，待蛋白包涵体析出；
2、吹打包涵体蛋白，收集在15mL或50mL离心管中，6000r/min离心5min。
3、加入5mL的包涵体溶解液，转移到干净透析袋里，在包涵体透析液1 4℃透析6-7小时。
4、换包涵体透析液2透析6-7小时。
5、把透析袋拿出来，放一干净板上，下面放干燥的PEG20000，吸收透析袋里面的水，达到浓缩的效果。
6、洗净透析袋表面，打开透析袋，回收蛋白。
洗干净用过的透析袋，放进酒精里浸泡。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
用层析法分离、复性包涵体
用层析法分离、复性包涵体谷振宇Jan-Christer Janson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。
将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。
分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。
在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。
溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品，然后加入到梯度形成好的层析柱中。
在层析过程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。
因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。
梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。
我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。
Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。
传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。
本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。
此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。
大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。
ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。
因此需要进行复性。
材料与方法脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。
GSSG，GSH购于Roche。
Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。
所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。
其它试剂均为分析纯。
实验用水为Millipore 纯水系统生产。
工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化秦样本
第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表示和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰, 容易培养, 能够大规模发酵, 以及大量可供选择利用的克隆和高效表示载体而成为当前人们克隆和表示外源基因的首选菌株。
可是, 在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表示往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点, 如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击, 而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解; 包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度, 有利于表示量的提高; 包涵体中杂蛋白含量较低, 且只需要简单的低速离心就能够与可溶性蛋白分离, 有利于分离纯化; 包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感, 易于破壁, 并与细胞膜碎片分离等。
可是, 无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质, 这一般是一件很困难的事情, 而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同, 因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明, 重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一, 是基因工程产品商业化的瓶颈, 也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因１．什么是包涵体所谓包涵体是指由于表示部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构( 如Cys含量高) , 如低电荷, 无糖基化等, 使得重组蛋白质与核酸, 周围杂蛋白质( 如核糖体元件、 RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、 ompF和ompA等) ,以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm, 具有很高的密度( 约 1.3 mg/ml) , 无定形, 呈非水溶性, 只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上, 它们没有生物学活性, 因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体的纯化和复性总结全
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
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我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。
再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。
所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。
至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。
如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。
TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
046 wrote:
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
先过柱後复性。
蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
溶液装在透析袋中，然后覆盖上一些PEG，10～30分钟，根据个体情况而定。
蛋白质的保存，当然最好的是冻干保存，但是如果放置时间不会太长，比如不会超过半年，
完全可以放在-80度保存。
包涵体能放置多久？这个问题不知道，包涵体又不是成品蛋白，放置那么久没什么用。
046 wrote:
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
要用TGE反复透析，一般8小时左右换一次透析液，透析三次左右。
PH值要调，一般透析液的PH值要根据等电点来确定。
最好距离等电点稍微远点，否则极易产生沉淀。
2.不知你的0 M尿素缓冲液中是否有NaCl等盐类，一些蛋白遇盐易沉淀！解决方法去掉一些盐类成分。
如将PBS改成PB，将其中的NaCl及KCl去掉，改为只含有两种磷酸盐的环境！此其一！
另外，蛋白复性时，如果本身折叠的不好，在最后变性剂从有到无时也是容易析出的。
所以前期一定要保证复性环境平缓，不能太剧烈。
可适当加入一些小分子物质（如L-Arg），或加入氧化还原体系等。
我的缓冲体系是50 mMTris,5% 甘油，1 mMEDTA,pH值7.9
措施：提高pH值为10，尝试稀释复性
3. 1. 沉淀出现的问题可以多看看文献，都有解释。
楼上正解，水化层和电荷问题很大。
2. 更关键的，复性是正确构象形成过程，中间熔球态疏水区外展，疏水聚沉
3. 现在都通过添加外源物起到辅助复性，这个说法有待商榷，应该叫做提高复性效率，毕竟要辅助复性，分子伴侣可能是必需的
4. 有沉淀可能并不是坏事。
最可悲的是“复性”后蛋白都是可溶的，但没有相应的生物活性。
这个“复性”是假象，可溶并不一定是复性成功，SDS-PAGE检测不出来而已。
5. 复性问题是个大坑，不太陷得太深，见好就收。
4.酶活测定
1. 2×反应基质（A液）：2ml Triton X-100，0.5g阿拉伯胶溶于450ml缓冲液。
2. 对硝基苯丁酸酯溶液（p-NPB）：3mg/ml,用异丙醇溶解。
3. 不同pH的缓冲液：其中3.0~6.0 用50mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；7.0,8.0 用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；9.0~11.0用50 mmol/L Gly-NaOH缓冲液。
反应采用1 ml体系：取350 μl ddH2O、500 μl A液和100 μl底物(p-NPB)在一定温度下恒温水浴温育5 min，然后加入50µl待测酶液，在该温度下恒温反应10min，加入1ml 95%乙醇终止反应，测定A410。
4.透析
(2)透析复性液的配置
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融合蛋白的复性及功能检测
复性液I:100mmol/LTris一HCI(pHS.O)!0.15mol几NaCI!1mmol/LED认!6mol/L 尿素
复性液n:复性液卜0.5mol/LL一Arg
复性液111:复性液I+0.1mmol/LGSSG/0.5mmol/LGSH
复性液1V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGssG/0.5mmol/LGsH
复性液V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGsSG/o.smmol几GsH+Zmmol/L CaC12
步骤：
(l)取保存在-20e冰箱中的纯化蛋白,加入DTT至终浓度为25mmol/L,
室温孵育2h"
(2)用含有8mol/L的尿素的Elutionbuffe:将蛋白稀释至所需浓度,取变性
蛋白2ml分别加入透析袋中开始透析
(3)将透析袋置于100mL透析液中,4OC透析复性,每3h换一次透析液,
共换5次,通过缓慢降低透析外液中的尿素浓度(4mol/L一2mol/L),最后将透析
外液换为PBS液,更换2次,共透析巧ho
(4)透析完毕,取出溶液,4度下,1200Orpm,离心30min,吸取上清,将
上清置于-40度冰箱中备用"
(5)采用考马斯亮蓝法测定上清中复性蛋白的含量,计算复性产率"
硕士论文：中介蝮(Gloudius diusintermedius)神经毒素磷脂酶A2原核表达包涵体的复性及低温可溶表达研究。