九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
流式细胞仪的原理和应用
流式细胞仪的原理和应用1. 引言流式细胞仪是一种常用于细胞分析和分选的实验室仪器。
它通过光学技术和流体力学原理，能够快速、准确地测量和分析细胞的各种参数。
本文将介绍流式细胞仪的原理和应用。
2. 原理流式细胞仪的工作原理主要包括以下几个部分：2.1 光学系统流式细胞仪通过激光束照射待测细胞，细胞内的荧光标记物被激发后会发出特定波长的荧光信号。
光学系统通过透镜、滤光片和光散射装置等光学元件，将细胞的荧光信号收集并转换为电信号。
2.2 流体力学系统流式细胞仪通过一个微细管道使细胞以单个细胞为单位通过检测区域。
流体力学系统通过控制细胞的流速和方向，确保细胞以适当的速度和位置通过激光束照射点，以确保准确的测量结果。
2.3 信号处理系统流式细胞仪的信号处理系统主要由放大器、模数转换器和计算机组成。
放大器将收集到的电信号放大到适当的范围，并将其转换为数字信号。
模数转换器将数字信号转换为计算机可以处理的数据，计算机则对这些数据进行分析和图像处理。
3. 应用流式细胞仪广泛应用于生物医学领域，常用于以下几个方面：3.1 免疫表型分析流式细胞仪可以通过检测细胞表面的特定标记物，如细胞膜上的抗原或细胞内的特定蛋白，来对细胞进行免疫表型分析。
这对于研究免疫系统、识别疾病标记物以及血液分析等应用具有重要意义。
3.2 细胞周期和凋亡分析流式细胞仪可以通过检测DNA含量的变化来研究细胞的分裂周期和凋亡过程。
这对于了解细胞生命周期、细胞增殖以及细胞死亡机制等方面的研究非常有帮助。
3.3 细胞分选与单细胞分析流式细胞仪还可以根据细胞的荧光信号和其他参数，对细胞进行分选。
通过设定合适的阈值，可以分别收集到不同亚群的细胞，从而进行后续的单细胞分析和研究。
3.4 体外受精和胚胎筛选流式细胞仪可以对体外受精过程中的精子和卵子进行分析和筛选，从而提高体外受精的成功率。
此外，对于胚胎的筛选和评估也可以使用流式细胞仪进行。
3.5 微生物学研究流式细胞仪对微生物的研究也具有重要意义。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
1.流式细胞仪原理及其在CD4检测中 的的应用
FITC
FITC
FITC FITC
FITC Number of Events FITC FITC FITC FITC
Fluorescent Intensity
CD3,CD19双荧光染色
CD19单阳性细胞
CD3单阳性细胞
电子系统
将光学信号转换成电子信号
Voltage Pulses
LIN Signal Out Photon In Voltage In PMT Power Supply LOG LOG
光学系统
两种信号，6个参数
FSC SSC
散射光信号
FL1 FL2 FL3 FL4
荧光信号
光学系统
SSC
Incident Light Source
FSC
• FSC（前向角散射光） 代表细胞大小
• SSC（侧向角散射光） 代表细胞粒度
人外周全血经过红细胞裂解后
光学系统
携带有不同荧光染料的细胞通过激光激发，产生 不同的荧光信号
细胞检测原理——荧光素
• 什么是荧光素 = 488 nm 照射光波长 H O
O C CO2 H 荧光分子
520 nm 发射光波长 抗体
• 荧光素吸收激光器发出光的能量 • 荧光素放出吸收的能量： – 振动能和热能. – 释放出更长波长的光
荧光素
• 发射光强度与抗原表达之间的关系
FITC
什么是流式细胞术？
• 定义：在流动的状态中检测单个细胞的多项理化 及功能性指标的一种细胞分析技术 • 特点：特异、灵敏、多元化、高速、客观、省时
流式细胞仪就是测量染色细胞标记物荧光强度
的分析仪
认识流式细胞仪
流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色细胞的相对荧光强度
流式细胞仪的技术原理及其在生命科学领域的应用
Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（别藻蓝蛋白）
PE-Cy7 conjugates Red 613 Fluorescein BODIPY-FL Cy3 TRITC X-Rhodamine Lissamine Rhodamine B PerCP Texas Red Cy5 Cy7 Allophycocyanin (APC) TruRed APC-Cy7 conjugates
-25-
-26-
外周全血细胞（红细胞溶解后）以散射光
（FSC/SSC) 表示的 双参数点陈图（dot plot）
-27-
外周全血细胞（红细胞溶解后）以散射光
（FSC/SSC) 表示的 双参数点陈图（dot plot）
-28-（二）流式细胞仪检 Nhomakorabea的参数 1: 光学参数
(2). 特征信息－荧光（Fluorescence）信号
Ex (nm) 325 350 360
375;400 425 466
480;565
480;565;650
480;565;743 480;565 495 503 512;552 547 570 570 490 589 625-650 743 650 490,675 650;755
Em (nm) 386 445 410 423 528 539 578
-20-
数据系统
-21-
（二） 流式细胞仪可检测的参数 1：光学参数
流式细胞仪原理及其在CD 检测中 的的应用
• 市场占有率：全球75%，中国70%, 中国CDC95％以上
认识流式细胞仪——BD公司
BD公司流式细胞仪分为二大类： •一类为临床型（Clinic），其特点为仪器的光路 调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学 易掌握。BD公司的临床型FCM FACSCan也是最 早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。 •另一类为科研型（Research）,其特点为可快速 将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指 定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，并且 可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛 的科学研究应用。
FL1
FSC
FSC SSC
FL1
FL2
FL3
内容安排
• BD公司介绍 • 免疫学基础 • 流式细胞仪原理 • 流式细胞仪在CD4检测中的应用 • 绝对计数管在CD4检测中的应用 • MultiSET软件和手动圈门 • Q&A
淋巴细胞的免疫表型
CD19
T淋巴细胞的免疫表型
• T淋巴细胞分类复杂，不同类型免疫表型的T淋 巴细胞的功能不同
lymphocytes 66
运行软件
运行质控 调用条件
优化设置
获取数据
分析数据
关闭软件
• Specify data collection information (file name, storage location, panels, etc.).
• Click Acquire.
• Gate manually, if needed.
获取数据
分析数据
关闭软件
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪原理与应用
流式细胞仪原理与应用流式细胞仪，听起来是不是有点高大上？它就像一个超级细致的筛子，把成千上万的细胞一一检阅。
这玩意儿的原理其实不复杂，简单来说，就是通过激光和光电探测器，给每个细胞“照个相”。
你想想，细胞们在液体中像小鱼一样游来游去，激光一照，它们的形状、大小、甚至颜色全都被捕捉到了。
就像每年夏天的聚会，大家都想在照片中美美的，这些细胞也一样，在流式细胞仪的“镜头”下，尽情展示自己。
说到应用，这可真是个大舞台。
比如，咱们可以用流式细胞仪来研究免疫细胞。
免疫细胞就像是身体里的小卫士，时刻准备保护我们免受病毒和细菌的侵害。
流式细胞仪可以帮我们看看这些卫士的数量、状态和活跃度，就像是给他们打分，看谁是当月的“优秀卫士”。
有些时候，细胞们的表现不太好，可能就是因为生病了，流式细胞仪这时候就成了“侦探”，帮助医生找出问题所在。
当然了，流式细胞仪的用途可不仅限于此。
比如在癌症研究中，它简直就是一把利器。
研究人员通过流式细胞仪，可以快速分辨出肿瘤细胞和正常细胞，就像在海量数据中找针一样。
这样一来，医生可以更好地制定治疗方案，真是应对癌症的“超级英雄”。
在药物研发过程中，流式细胞仪也扮演着重要角色。
新药开发时，要看看药物对细胞的影响，流式细胞仪就能轻松搞定，分析细胞的反应，就像吃饭前先问问大家口味一样。
在临床诊断方面，流式细胞仪也大显身手。
比如说白血病的诊断，流式细胞仪能够识别异常细胞，帮助医生制定更精准的治疗方案。
要知道，早发现早治疗，这可是常识。
这个仪器的速度也很快，几秒钟就能处理成千上万的细胞，效率杠杠的。
想想看，以前做实验可得耗费多少时间，现在一下子就搞定了，简直是节省时间的“神器”。
用流式细胞仪的时候，操作人员可得小心翼翼，毕竟这玩意儿精细得很。
设备需要调试得当，细胞悬液的浓度也得合适，才能确保结果准确。
就像做菜，配料不对可就难以下咽。
不过，掌握了窍门，使用起来也不算难。
随着技术的发展，现在有很多智能化的设备，操作界面友好，基本上新手也能很快上手。
流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪的原理及应用
FACS Aria-高速 分选的台 式机
FACS Diva 高速分选的数 字化大型机
贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品
• FC 500 全自动分析仪
Gallios 双激光6色
EPICS ALTRA分析分选系统
AppliedBiosystems公司
• AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪
流式细胞仪的临床免疫学应用
• 淋巴细胞免疫分型
• 细胞移植的交叉配型和免疫状
淋巴细胞亚群分析
态监测
CD4绝对计数 • HIV与SARS的诊断与研究
• 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究
淋巴细胞CD4/CD8分析 淋巴细胞的增殖
CD4绝对计数
树突状细胞的研究
T细胞活化
• HLA-B27检测
淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析
• 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色 染色，同时对淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原 （CD分子）的表达进行分析，可以将淋巴细胞亚 群区分开，并定性分析；
• 淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析
临床意义
• 了解在不同情况下体内免疫功能状态 • 辅助临床疾病的诊断 • 探索疾病的发病机理、病程、预后 • 监测、指导临床治疗方案 • 免疫系统疾病 • 免疫缺陷病，AIDS • 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 • 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
光信号检测 散射光信号
流式细胞仪的原理与应用
流式细胞仪的原理与应用原理介绍流式细胞仪是一种常用于生命科学研究的仪器，用于对细胞进行高通量分析和计数。
它通过将悬浮细胞排列成单个细胞，然后利用激光照射细胞并检测产生的荧光或散射光信号，来获得关于细胞的多种信息。
流式细胞仪的原理包括以下几个关键步骤：1.细胞样本的制备：将细胞样品制备成单细胞悬浮液。
2.细胞的流式：将细胞悬浮液通过细胞流动系统，使细胞以单个细胞的形式通过激光束。
3.激光照射：使用激光束照射细胞，激发细胞产生荧光信号或散射光。
4.光信号检测：使用光学系统收集并分析细胞产生的荧光信号或散射光。
5.数据分析：将收集到的数据进行分析和解读，得出关于细胞的信息。
应用领域流式细胞仪广泛应用于生命科学相关的领域，包括以下几个方面：免疫学研究流式细胞仪可以用于研究免疫学领域的诸多问题。
通过标记特定的细胞表面分子，流式细胞仪可以定量和定性地分析细胞亚群的分布和表达水平。
例如，可以通过测量细胞表面抗原的表达来评估免疫细胞的激活状态。
此外，流式细胞仪还可以用于分析细胞因子的产生和分泌，从而揭示免疫响应的机制。
癌症研究流式细胞仪在癌症研究中起着重要的作用。
它可以用于检测和分析肿瘤细胞的特征。
通过染色或标记特定的肿瘤标志物，流式细胞仪可以帮助研究人员识别和定量肿瘤细胞，并对其进行分析。
此外，流式细胞仪还可以用于研究肿瘤细胞的增殖和凋亡过程，以及肿瘤细胞克隆和转移的机制。
神经生物学研究流式细胞仪在神经生物学研究中也有广泛应用。
通过使用特定的标记，可以对神经细胞或其他神经元亚群进行表型和功能研究。
例如，可以使用流式细胞仪来检测和分析特定神经细胞亚群的神经递质受体的表达水平，从而揭示神经细胞间相互作用的机制和功能。
细胞治疗流式细胞仪在细胞治疗中也有重要的应用。
细胞治疗是一种利用细胞修复和替代受损组织的方法。
流式细胞仪可以被用来富集和纯化特定的细胞亚群，以获取足够数量的细胞用于治疗。
此外，流式细胞仪还可以用于评估治疗的效果，例如通过分析细胞增殖或功能的变化来评估细胞治疗的效果。
流式细胞术的原理及临床应用介绍
流式细胞术的原理及临床应用介绍
一、引言
流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的细胞分析技术，它可以
通过对单个细胞的物理和化学特征进行检测以实现细胞的分类、计数、分析和分类。
本文将介绍流式细胞术的原理及临床应用。
二、原理
流式细胞术的原理是先将细胞溶液通过一系列的管道和阀门分别分离
和分离，然后将细胞与荧光染料或抗体等特异性标记物结合，使细胞
获得荧光性或表面标记，接着将细胞注入流式细胞仪，在流动的流体
中使细胞连续通过单一通道，荧光或标记在此过程中被依次检测。
最后，由计算机进行数据统计、分析和分类。
三、临床应用
1.癌症诊断和治疗监测
利用流式细胞术的高灵敏度和特异性，医生可以获得更准确的癌症诊
断结果，同时也可以监测病人的治疗状况和治疗进展情况，不仅可以
改善病人的生活质量，而且可以提高癌症治疗的疗效。
2.免疫学研究
流式细胞术可以用于深入了解整个免疫系统的结构和功能，包括淋巴
细胞、单核细胞和巨噬细胞等的生物学活动。
这可以帮助研究人员更
好地理解癌症等疾病的发生和发展机制，并根据这些机制来开展基于
流式细胞术的治疗方法。
3.病毒学研究
针对病毒学研究，流式细胞术已成为重要的工具。
通过仔细分析CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活动和响应，我们可以更好地理解病毒感染的机制，也能够更好地评估疫苗效果。
四、结论
流式细胞术是一种高度灵敏和特异的细胞分析技术，在临床实践中得到了广泛的应用。
它在癌症诊断和治疗、免疫学研究和病毒学研究等领域都有很好的表现，为生物医学研究和治疗带来了巨大的进展。
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪原理及应用流式细胞仪（flow cytometry）是一种高效、高通量、多参数的细胞分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
本文将介绍流式细胞仪的原理及其在生命科学研究中的应用。
流式细胞仪的原理主要基于细胞对激光光束的散射和荧光信号的检测。
当细胞悬浮在流式细胞仪的流动系统中通过激光束时，细胞会散射出前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
FSC反映了细胞的大小，而SSC反映了细胞的复杂性和颗粒度。
此外，流式细胞仪还可以检测细胞内荧光标记物的荧光信号，通过这些信号可以对细胞进行多参数分析，包括细胞表面标记物、细胞周期、DNA含量、细胞凋亡等。
在生物医学研究中，流式细胞仪被广泛应用于细胞表型分析、细胞凋亡检测、细胞周期分析、免疫细胞表型分析等领域。
例如，研究人员可以利用流式细胞仪对肿瘤细胞进行表型分析，以了解肿瘤细胞的表面标记物表达情况，从而为肿瘤治疗提供依据。
此外，流式细胞仪还可以用于检测细胞内钙离子浓度、ROS生成、线粒体膜电位等生物学参数的变化，为细胞功能研究提供重要数据支持。
在临床诊断中，流式细胞仪被广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学等领域。
例如，流式细胞仪可以用于血液细胞分型、白血病和淋巴瘤的诊断与分型、免疫细胞表型分析等。
通过对患者血液或组织样本的流式细胞分析，临床医生可以更准确地诊断疾病类型，评估疾病预后，指导治疗方案的选择。
另外，流式细胞仪还被广泛应用于药物研发领域。
研究人员可以利用流式细胞仪对药物对细胞的影响进行评价，包括细胞毒性、细胞凋亡诱导、细胞周期阻滞等。
通过流式细胞仪的高通量分析，可以快速筛选出具有潜在药物活性的化合物，为新药研发提供重要的支持。
总之，流式细胞仪作为一种高效、高通量、多参数的细胞分析技术，在生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和完善，相信流式细胞仪将在未来发挥更加重要的作用，为生命科学研究和临床医学带来更多的突破和进步。
流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理及应用1. 导言流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种强大的生物学分析技术，可用于对细胞进行精确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞仪的原理以及其在不同领域中的应用。
2. 流式细胞仪的原理流式细胞仪通过激光器将单一细胞注入到来自样品的悬浮液中，并对其进行流式检测。
其原理主要包括以下几个步骤：2.1 细胞悬浮液的制备将待测样品进行预处理，并将细胞转化为单细胞悬浮液。
这通常涉及到细胞的离心、洗涤和溶解等步骤，以确保获得单一、可靠的细胞样本。
2.2 细胞的注射将细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过液压系统控制细胞的流速和数量，确保适量的细胞满足检测要求。
2.3 激光照射和荧光检测流式细胞仪使用高功率激光器照射经过细胞的细胞悬浮液。
这些激光器可以刺激样品中的荧光染料、标记物或其他荧光探针。
细胞在受到激光照射后会发出荧光信号，流式细胞仪则利用光电倍增管检测并记录这些信号。
2.4 数据分析流式细胞仪所得到的原始数据将通过计算机进行处理和分析，以提取相关的参数和信息。
数据可以按照细胞数量、细胞表型及细胞活性等不同参数进行分类和分析。
3. 流式细胞仪的应用3.1 生命科学研究流式细胞仪在生命科学领域的研究中扮演着重要角色。
它可以用于研究细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖以及细胞表型的分析。
流式细胞仪能够分析多个标记物的表达情况，帮助研究人员识别不同的细胞类型，并进行进一步的功能研究。
3.2 临床诊断流式细胞仪在临床诊断中也得到了广泛的应用。
它可以通过检测多种荧光标记物来识别和分类血液细胞，并进行疾病的诊断。
例如，在白血病的早期诊断中，流式细胞仪能够检测异常细胞的存在，提供重要的诊断依据。
3.3 免疫学研究流式细胞仪在免疫学研究中被广泛应用。
它可以辅助进行免疫表型分析、细胞介导的免疫反应监测以及细胞因子的检测。
流式细胞仪的高通量性能使得大规模分析成为可能，帮助研究人员深入了解免疫系统的功能和疾病的发展机制。
流式细胞仪基本原理和临床应用
Fluorescence Intensity
细胞凋亡检测技术
1 几个概念
2 技术和方法
1 荧光信号的面积：对荧光光通量 进行积分
2 DNA指数(DI)：相对DNA含量
3异倍体：非二倍体，包括近二倍 体，四倍体，多倍体，非整倍体
凋亡细胞的特点
➢ 在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核 膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器 密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲， 但早期细胞膜的完整性未受到破坏
流式细胞仪 分选系统
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
流式细胞 仪的应用
流式细胞仪的科研应用
➢ 细胞表型分析 ➢ 胞内细胞因子的检测 ➢ 染色体分类研究 ➢ 细胞周期和DNA倍体分析 ➢ 流式标准小球定量 ➢ 分选 ➢ 细胞内钙离子测量
流式细胞仪的光学系统
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过 聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上， 被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生 散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向 光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。 光散射信号在前向小角度进行检测，这种信 号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号 的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色 性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不 同波长的荧光信号。
号越强
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可 分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统 计分析
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪原理及应用流式细胞仪是一种用于细胞计数和表征的仪器，它基于细胞在流体中流动并通过光源的原理。
以下是流式细胞仪的原理和一些常见应用。
原理：1. 细胞准备：样品中的细胞首先需要进行适当的处理，包括细胞分离、去除细胞团块和杂质等，以确保流经流式细胞仪时的均匀性和准确性。
2. 细胞传递：样品中的细胞通过封闭的通道流动，形成单个细胞的串行排列，以便每个细胞能够单独接收光信号。
3. 激光照射：流式细胞仪使用激光器产生高强度的单色光束，照射到细胞上。
4. 光散射和吸收：细胞与经过的激光光束相互作用，发生光散射和吸收现象。
这些现象提供了关于细胞大小、形状、复杂度和细胞表面分子的信息。
5. 光信号收集：流式细胞仪使用多个光学组件和探测器来收集光信号。
不同的检测器可以收集不同的光散射角度和波长的光信号。
6. 数据分析：收集到的光信号通过计算机进行处理和分析，可以获得细胞的数量、计数、分类和细胞表面分子的信息。
应用：1. 细胞计数：流式细胞仪可以快速准确地计数细胞数量，并提供关于细胞浓度和细胞增殖的信息。
这在生物学研究和临床实验室中非常常见。
2. 细胞表征：通过测量细胞的大小、形状和表面标记物等特征，流式细胞仪可以对细胞进行表征，并帮助研究人员了解细胞类型和状态的变化。
3. 免疫细胞分析：流式细胞仪可以用于免疫学研究，如分析免疫系统中的不同细胞亚群、检测细胞表面抗原、测量细胞分泌物和研究细胞凋亡等。
4. DNA和蛋白质分析：通过使用荧光染料或抗体标记，流式细胞仪可以实现对DNA含量、染色体多样性以及特定蛋白质的定量和定位分析。
总之，流式细胞仪是一种功能强大的实验室工具，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域，为研究人员提供了大量有关细胞的信息。
流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪的原理和用途流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。
流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。
其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。
1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。
其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。
近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。
这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。
由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。
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免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
Dynabeads技术计数CD4细胞
原理
用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
●流式细胞仪内部结构
▲光学系统 激光光源 光收集系统 ▲液流系统 流动室 液流驱动系统 ▲电子系统 光电转换 数据处理系统 ▲细胞分选系统
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少
CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒臵，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
基本工作原理
散射光的测定
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光测量
荧光染料被激发而发射的光信号
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
优点
优点
FCM 技术
-简单 -低廉
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高
-高通量
-金标准技术
缺点 缺点
-低通量
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
-难于质控
仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞 仪（ FACSCalibur、Coulter)
SSC
CD45 PerCP
细胞亚群的细胞获取数 X Beads获取数
Beads 总量 = 样本量 (µl)
细胞亚群的 绝对数（细胞数/µ l） MMWR, 2003: 52(RR02);1-13
CD4绝对计数结果
BDB FACSCountTM 系统
内置微处理 器实现数据 自动分析 自动打印质控与 病人的检测结果 简单易用的系 统控制面板 配套的样本 制备工作台 简捷的样本制备方 法，避免细胞损失
仪器性能
样本稳定性 制备后室温(20—25 0C)储存48小时 全血稳定性 采集后室温(20—25 0C )储存48小时
仪器性能
范围 CD4+: 50-2000个细胞/ uL CD8+: 100-2000个细胞/ uL CD3+: 100-3500个细胞/ uL
检测试剂盒组成（50人份/盒） 荧光试剂 2个组合/人份
实验中质量控制
①质控品的准备； ②试剂的评价选择 ③ 仪器的校准 ④开展Levey-Jennings 质控图质控（或“即刻法”质控）。
实验后质量控制
①实验后准确填写检验结果； ②及时发出报告； ③正确地解释检验结果的临床意义 ④文件管理
实验前质量控制
特别注意
运输温度：室温
运输时间： 双平台<6小时，单平台<24 小时 样品处理：专人，及时， 规范。
1、液流系统
流动室
包裹样本流 使之位于喷嘴中心
流体动力学聚焦
激光聚焦
2、光学系统：激光光源、分色反光镜、光束成形 器、透镜组、滤片、光电倍增管
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收并转化为电信号。 激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞 前向 散射 光 收集透镜 带通滤波片 光电倍增管
数据处理系统
方法
价格：3美元/人份
流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
●FCM的特点
保持细胞及细胞器或微粒的结构及功
能不被破坏
从分子水平获取多种信号
对细胞进行定量分析或纯化分选
传统的FCM: 单平台法
-只需一台仪器 -较少的制备和分析步骤 -非常昂贵
美国CDC 推荐 (2003)
单平台测定CD4+ T 细胞绝对数指南 - FDA 批准的商业荧光微球计数试剂
- 以 CD45 设门
- 三或四色流式细胞仪
三色组合 1) CD3/CD4/CD45 2) CD3/CD8/CD45
<50
CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病 组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程 症状期 无症状期 CD4+T淋巴细 胞 任何值 CD4+T细胞 <200/mm3 病毒载量 任何值 任何值 建议 治疗 治疗
CD4+T细胞 无症状期 >200/mm3，但 <350/mm3
CD4PE/CD3PE-CY5
CD8PE/CD3PE-CY5
固定液 效期 2—8 0C储存6个月
质控试剂盒（50人份/盒）
零，低，中，高
4种靶值微球 效期 2—8 0C储存1个月
使用简单方便
安装简便，一体式设计，无需外源计算机 即开即用，无需调试校准 全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体 自动错误报警
实验中质量控制
350 300
© ¸ û ý ¨ö C D 4 Ï °Ê £ ¸ / u l £
309 266
333
VL log copies/ml
6 5 4 3 2 1
250 200 150 100 50 0 d0 4w 165
12w
24w
0
Î Æ ±ä Ö Á Ê ¼
d0
4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
Infection
Seroconversion
HAART
Death
CD4 T cell depletion
1000 CD4 T cells/ml
500 200 0
2-6 weeks
mean of 10 years
Flu-like Disease
Asymptomatic phase
Symptomatic phase
线性放大：信号强度变化范围较少、生物学线性过程 对数放大：信号强度变化范围较大、光谱信号复杂
特异荧光
自发荧光
特异荧光
数据的显示与分析
参数 FS SS FL
数据显示方式
单参数直方图
一维参数（荧光或散射光） 与颗粒技术（Count）构成， 反映同样荧光强度的颗粒 数量的多少
横坐标：光信号波长相对 值（信道） 纵坐标：被测细胞的相对 数量
AIDS
成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
临床阶段
CD4+T细胞 A 无症状或急性HIV感 染或持续性全身淋巴结 肿大 A1 A2 B 出现症状， 不是A或C B1 B2 C 艾滋病指针性症 状 C1 C2
>500/ul （≥29%） 200-499/ul （14-28%） <200/ul （<14%）
无症状期 CD4+T细胞 >350/mm3
建议治疗。另外还要根据 >30000（bDNA）或 CD4+T细胞下降率和患者的 >55000(RT-PCR) 愿望
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治 <55000(RT-PCR) 疗者3年发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪 （ FACSCount、Guava)
3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议 用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于 1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。
非流式细胞技术
双参数直方图
点图 二维等高图：等高 线连接相同细胞数 的点
密度图
假三维等高图
三参数直方图
流式细胞仪的多参数分析
Region设臵 指在同
CD14 PE (log)
一张单参数或双参数
直方图上根据信号的 强弱划定分析区域， 从而计算分析区域内 的细胞数量。
CD45 FITC (log)
实验报告
报告项目
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD4/CD3 CD8/CD3
自动设定分析区域