BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV的感染应答
家蚕生长阻遏肽结合蛋白与杆状病毒P13蛋白互作关系的研究
家蚕生长阻遏肽结合蛋白与杆状病毒P13蛋白互作关系的研究邓培渊;王国霞;王辉;李玉华;李长看【摘要】为探明生长阻遏肽结合蛋白(Growth blocking peptide binding protein,GBPBP)与杆状病毒P13蛋白的互作关系,以家蚕Bombyx mori Linnaeus 为供试昆虫,采用GST pull-down试验的方法,检测了家蚕生长阻遏肽结合蛋白(BmGBPBP)与黏虫核型多角体病毒P13蛋白(LsP13)间的相互作用.结果表明,GBPBP蛋白与P13蛋白发生了结合反应,暗示两者生理功能之间具有一定的联系.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2015(049)005【总页数】5页(P641-645)【关键词】家蚕;GBPBP;LsGBPBP;P13蛋白【作者】邓培渊;王国霞;王辉;李玉华;李长看【作者单位】郑州师范学院,河南郑州450044;郑州师范学院,河南郑州450044;河南中医学院第一附属医院,河南郑州450000;郑州师范学院,河南郑州450044;郑州师范学院,河南郑州450044【正文语种】中文【中图分类】Q966核型多角体病毒(Nucleopolyhedro viruses，NPVs)是一类广泛用于害虫生物防治的杆状病毒。
根据其分子亲缘关系和是否含有包膜糖蛋白GP64，分为I型和 II型2个组［1］。
其中鳞翅目昆虫的核型多角体病毒属于II型杆状病毒，在这类病毒的基因组中普遍存在一种P13基因［2-5］，不仅在病毒侵染昆虫细胞的过程中持续表达，而且对下游基因的表达也有负调控作用［6］。
研究还发现，P13蛋白是一类与病毒杀虫活性相关的蛋白，但对其杀虫作用的分子机理尚不明确［7］。
生长阻遏肽(Growth blocking peptide，GBP)是存在于昆虫血淋巴中的一类多肽，已从黏虫Mythimna(Leucania)separata、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae和斜纹夜蛾Spodoptera litura等多种鳞翅目昆虫中分离鉴定出来［8-11］。
感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析
感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能分析摘要：家蚕 (Bombyx mori) 是重要的经济昆虫，然而，它常常受到家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的侵袭。
为了抵御病毒入侵，家蚕免疫系统会调控一系列与抗病毒相关的基因。
本研究采用高通量测序技术，对BmNPV感染与非感染家蚕的转录组进行了比较，以揭示家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能。
引言：家蚕是一种重要的经济昆虫，广泛应用于丝绸和蚕茧的生产。
然而，病毒感染严重影响了家蚕的产量和质量。
BmNPV是最常见的家蚕病毒之一，能够引起严重的病害。
为了抵御病毒入侵，家蚕免疫系统通过调控抗病毒相关基因的表达来增强自身的抵抗力。
本研究旨在通过分析感染BmNPV与非感染家蚕的转录组差异，揭示家蚕免疫系统相关基因的差异性表达和功能。
方法：本研究选取BmNPV感染和非感染家蚕的肝胰腺组织作为样品，进行了转录组测序。
首先，提取样品总RNA并进行纯化。
然后，利用逆转录酶将RNA转换为cDNA，接着使用Illumina HiSeq 2500平台进行二代测序。
得到的测序数据经过质控和过滤，最后进行了比对和基因差异表达分析。
结果：通过转录组测序和分析，我们共找到了xxx个差异表达基因（DEGs）。
进一步分析显示，这些差异表达基因主要涉及免疫调节、抗病毒反应和信号转导等生物学过程。
其中，一些基因的表达在感染BmNPV时上调，而另一些基因则下调。
这些差异表达基因包括关键的免疫相关基因，如Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）、抗菌肽和免疫信号转导分子。
进一步的功能富集分析显示，感染BmNPV家蚕免疫系统相关基因主要涉及信号转导途径、炎症反应和免疫反应调节等功能。
这些结果揭示了感染BmNPV时家蚕免疫系统受到激活，并通过调控基因表达来抵御病毒入侵。
BmNPV_侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析
引用格式：刘 勇，龚椿营，艾均文，等. BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析[J]. 湖南农业科学，2023（11）：1-9，13. DOI:DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.011.001蚕桑文化是中国文明的起点，至少已有4 000 a 以上的历史。
家蚕作为重要的经济昆虫对人类文化、经济发展贡献巨大。
种桑养蚕至今仍是部分地区农民的重要收入来源。
然而生产上，家蚕始终受到细菌病、病毒病等的侵害，给农户造成一定的经济损失[1]。
其中，以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）引起的血液型脓病对蚕桑产业的威胁最大，其传染性极强，一旦发病就难以控制[2]。
目前，环境消毒仍是预防蚕桑病害的主要措施，但该防治方法费时费力，严重制约了蚕桑业的发展。
在此背景下，学者们通过传统杂交育种、分子标记育种和转基因育种等方式选育抗性品种来预防家蚕频发性血液型脓病，虽然这种方式前期投入大、开发周期长，但是一旦成功选育出抗性品种，其经济效益、社会效益和生态效益都是不可估量的[3]。
因此，基于材料间所存在的抗性差异而进行家蚕抗病基因筛选、抗病机制解析成为近年来蚕桑领域的热门课题。
BmNPV是一种环状双链DNA的核型多角体病毒，具有包涵体衍生病毒（occlusion-derived virus，ODV）和出芽型病毒（budded virus，BV）2种不同形式，侵染家蚕的方式包括ODV引起的食下感染和BV引起的创伤感染[3]。
BmNPV在家蚕体内复制增BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析刘 勇，龚椿营，艾均文，薛 宏，何行健，贾超华，陈卓华，任立志（湖南省蚕桑科学研究所，湖南长沙 410127）摘 要：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是造成蚕业严重经济损失的主要病原体之一，主要通过食下感染引发家蚕血液型脓病，中肠是免疫病原体的重要组织器官。
《家蚕遗传育种学》习题库(含答案)
《家蚕遗传育种学》习题集第一部分习题绪论1、简述家蚕遗传学和育种学的关系。
2、过去的一个世纪里，家蚕遗传育种学经历了哪几个主要发展阶段？目前的主要发展特点为何？3、近代家蚕品种研究有何特点？4、二十一世纪家蚕品种研究可能有哪些方向？第一章形态性状的遗传1、名词解释（1）p群基因（2）E群基因（3）黄体色（4）龙角（5）虎斑（6）褐圆斑（7）狭胸（8）螯虾蛹2、简答（1）等位基因和相似性状非等位基因的命名有何区别？（2）家蚕卵形态性状主要包括哪几个部分？各自的遗传规律怎样？（3）家蚕白色卵类、褐色卵类、灰色卵类的主要种类及其遗传特点为何？（4）田中和蒋同庆关于家蚕基楚斑纹、附加斑纹的划分有何不同？（5）油蚕成因为何？有哪些主要种类？（6）黄血基因与黄红茧系茧色有何关系？（7）显性白茧的实质是怎样的？3、分析比较题（1）已知家蚕第2白卵（w-2）对与其独立遗传的红色卵（re）基因表现上位作用，请图示w-2与re杂交的F1、F2基因型、表型、分离比。
（2）图示家蚕互补绿茧（Ca/Ga Gb/Gb）与纯合白茧（+/+ +/+）杂交后代的分离情形。
4、叙述题叙述家蚕赤蚁性状突变基因的种类、特征、遗传特点及相互关系。
第二章连锁遗传1、名词解释（1）基因分析（2）相引/相斥（3）基因定位（4）连锁遗传图2、简答什么是家蚕连锁遗传的最大特点？在基因分析中有何利用？3、分析题已知家蚕幼虫虎斑（Ze）基因和黄体色（lem）基因均属于第3连锁群，现选择一个既是虎斑又是黄体色的系统与正常型（非虎斑和正常体色）系统杂交，请写出其亲本（P）、F1、F2世代的基因型、表型与F2的分离比。
4、分析计算题已通过连续分析探明，家蚕隐性灰卵（gr-r）基因属于第2连锁群。
隐性灰卵系统为姬蚕（p）、白血（+Y），通过与暗色斑（P M）黄血（Y）系统杂交进行基因定位，F1雄与该隐性灰卵雌测定，其性状分离调查结果如下表（其中基因符号代表表型）：（gr-r++）♀× [（gr-r++）×(+P M Y)]F1♂性状分离情况表现型个体数gr-r p + 1084+ P M Y 1019+ P Y 111gr-r P M+ 102gr-r P Y 310+ P M+ 286+ P + 3gr-r P M Y 1（1）写出两亲本的基因型；（2）确定gr-r、P M、Y三基因的直线顺序；（3）计算出双交换值和三基因两两间的单交换值；（4）绘出三基因的连锁图。
家蚕BiP基因的克隆及其对家蚕核型多角体病毒感染的影响
家蚕BiP基因的克隆及其对家蚕核型多角体病毒感染的影响樊峰秀;李陈亚;Charles Amanze;郝碧芳
【期刊名称】《江苏科技大学学报:自然科学版》
【年(卷),期】2022(36)1
【摘要】结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP)是一种分子伴侣蛋白,可促进蛋白正确折叠,并可能在病毒感染过程中发挥重要作用.从家蚕卵巢细胞中扩增了BiP基因,该基因全长为1977 nt;家蚕和其他6种昆虫多序列比对显示BiP在物种进化过程中保守性较强,家蚕与小菜蛾、黑脉金斑蝶BiP同源性最高,为94.97%;进化分析也显示与小菜蛾的亲缘关系最近.免疫印迹检测显示BiP在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染的细胞中表达上调.当利用siRNA敲低家蚕细胞中BiP表达后,BmNPV的感染效率显著降低.本研究结果为深入解析BiP基因在BmNPV感染家蚕过程中所发挥的作用提供参考.【总页数】6页(P110-115)
【作者】樊峰秀;李陈亚;Charles Amanze;郝碧芳
【作者单位】江苏科技大学生物技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
【相关文献】
1.广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因r克隆与序列分析
2.家蚕核型多角体病毒orf25基因在病毒感染过程中编码一个30kDa的晚期蛋白
3.家蚕3-羟酰辅酶A脱
氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达4.家蚕核型多角体病毒四方形多角体突变株多角体蛋白基因的DNA序列分析5.家蚕核型多角体病毒对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的影响
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BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的中肠蛋白质组变化分析
蚕桑通报 2009 年 第 40 卷 第 1 期
图1 P50和306家蚕品种5龄中肠蛋白质双向电泳图谱 Fig. 1 Midgut 2D-PAGE protein profiles of silkworm breed P50 aiculture
第40卷 第1期 2009年2月 Vol.40 No.1 Feb., 2009
BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的 中肠蛋白质组变化分析
兰天云 1，2， 陈金娥 2， 张金卫 3， 杨惠娟 2， 李建营 2， 丁 农 3， 钟伯雄 2， 段家龙 1 （1. 安徽农业大学 生命科学学院， 安徽 合肥 230036； 2. 浙江大学 动物科学学院， 浙江 杭州 310029；
(1. College of Life Science, Anhui Agriculture University, Hefei 230036, China; 2. College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 3. Huzhou Academy of Agriculture Sciences, Huzhou 313000, China)
Abstract: To understand the proteome changes of silkworm midgut after infected by BmNPV as well as to find out the anti -BmNPV related genes, antivirus experiments were carried out in the nine different silkworm breeds. Results found an antivirus silkworm breed P50 and a susceptible breed 306 and they had a great difference in the antivirus ability. The antivirus ability in the anti-BmNPV individuals of P50 were 72 centesimal points higher than that of the 306. The midgut protein expression profiles of the P50 and 306 on the first (1st) day and the fourth (4th) day of fifth instar after oral infected by BmNPV were analyzed by 2-dmension eletrophoresis. The results showed that the first day of the fifth instar after the infection 10 specific protein spots were found in both P50 and 306 breed, respectively. There were 33 specific protein spots on the fourth day were found in 306 while 14 were found on that of P50 and these proteins were different in the characters. These proteins may be involved in the antivirus ability to BmNPV in the anti-breed and the susceptibility to BmNPV in the susceptible breed. Keywords: Bombyx mori; BmNPV; Midgut; Proteomics
BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响
BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响唐芬芬; 杨伟克; 朱峰; 邵榆岚; 张永红; 白兴荣【期刊名称】《《南方农业学报》》【年(卷),期】2019(050)010【总页数】6页(P2308-2313)【关键词】家蚕; 家蚕核型多角体病毒(BmNPV); SOD; CAT; 酶活性; 基因表达【作者】唐芬芬; 杨伟克; 朱峰; 邵榆岚; 张永红; 白兴荣【作者单位】云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自 661101【正文语种】中文【中图分类】S884.510 引言【研究意义】家蚕是一种重要的经济昆虫，同时是鳞翅目昆虫的模式生物，加之遗传背景清晰且饲育简单，已发展成为研究宿主—病原互作机制的理想材料（Geng et al.，2016a，2016b）。
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）在维持生物体内自由基代谢平衡的过程中发挥重要作用，在一定程度上能反映生物的抗逆能力（Lesser，2006；方允中和郑荣梁，2008）。
因此，研究抗氧化酶活性及其基因表达在家蚕抵抗病原微生物侵染过程中的变化规律，尤其是明确其在家蚕抵抗家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）时的功能和作用，可为揭示BmNPV侵染及其致病机理提供理论依据。
【前人研究进展】BmNPV感染主要引发家蚕血液型脓病，传染性强，危害严重，每年给桑蚕产业带来巨大经济损失（邵榆岚等，2017）。
据家蚕流行病学调查发现，BmNPV是云南蚕区发生较广且危害严重的主要病原（白兴荣等，2010），生产上多在三龄蚕后感染发病，且一旦发病即迅速蔓延。
虽然关于家蚕抵抗病毒的研究已有大量报道，但抗病机制至今尚未完全明确。
昆虫遭受外源病原菌侵染时，其机体内正常的代谢平衡被打破，诱发活性氧（ROS）过度积累，进而损伤宿主细胞（Kumar et al.，2003）。
家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展
家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)005【摘要】追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义.文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性；再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能.另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因—蛋白、蛋白—蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料.【总页数】5页(P854-858)【作者】覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐【作者单位】广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005;广西大学农学院蚕学研究所,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】S884.51【相关文献】1.对构建的家蚕抗核型多角体病毒病近等基因系的评估 [J], 刘晓勇;姚勤;陈克平2.家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展 [J], 覃吕高;屈达才;李俊;徐周徐;3.短时热激后家蚕对核型多角体病毒的抗性及相关抗菌肽和热激蛋白基因表达水平的变化 [J], 唐芬芬;郑亚强;白兴荣;陈斌4.家蚕核型多角体病毒orf25基因在病毒感染过程中编码一个30kDa的晚期蛋白[J], 王海燕;陈克平;郭忠建;姚勤5.家蚕抗核型多角体病毒病研究进展 [J], 邢东旭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
家蚕对病毒感染抵抗性生理生化机制研究综述
家蚕对病毒感染抵抗性生理生化机制研究综述
吴友良
【期刊名称】《江苏蚕业》
【年(卷),期】1991(000)001
【摘要】本文介绍了近年在家蚕对病毒(CPV、NPV、IFV、DNV)感染抵抗性生理生化机制方面的研究进展。
包括家蚕不同品种、不同发育阶段对病毒感染抵抗性的生理生化机制和不同伺育温度、不同叶质影响家蚕对病毒抵抗性的生理生化机制以及绝食饥饿、低温刺激引起家蚕对病毒抵抗性下降的生理机制。
【总页数】4页(P1-4)
【作者】吴友良
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S881.2
【相关文献】
1.小麦抗旱性生理生化机制及 QTL 研究进展 [J], 张维军;袁汉民;陈东升;王小亮;亢玲;何进尚
2.辣椒疫霉对双炔酰菌胺抗药性生理生化机制研究 [J], 赵卫松;张小风;齐永志;王文桥;韩秀英
3.油菜抗寒性生理生化机制及基因工程研究进展 [J], 贾明珍;官春云
4.作物抗旱性生理生化机制的研究现状和进展 [J], 孙彩霞;沈秀瑛;刘志刚
5.家蚕对浓核病毒感染的抵抗性与其它性状的相关性 [J], 唐聘芳;蔡平钟
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家蚕BmNPV压力选择品系的细菌病发生及其病原分离鉴定
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2023，54（11）：3388-3395ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.11.025家蚕BmNPV压力选择品系的细菌病发生及其病原分离鉴定邵榆岚，范永慧，范仕弘，张永红，张一川，白兴荣*（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南红河州661101）摘要：【目的】调查鉴定核型多角体病毒（BmNPV）压力选择家蚕相关品系细菌病发病原因，为蚕作生产上家蚕抗BmNPV品种细菌病防治提供理论依据。
【方法】相同批次和饲养条件下，对BmNPV压力选择自建品系P50Nn（n表示代）和抗BmNPV品种4个母种品系苏N、菊N、明N、虎N的正常保种组发生家蚕细菌病情况进行初步调查，分离培养病蚕肠道细菌，开展16S rDNA分子鉴定、革兰氏染色和扫描电镜等形态学鉴定，以及糖发酵、吲哚试验等20项生化鉴定。
【结果】细菌病导致家蚕BmNPV压力选择品系添食BmNPV第3代次的P50N3结茧率为47.63%，抗BmNPV育种母种品系添食BmNPV多代次的菊N结茧率最低为34.72%，而未添食过BmNPV的对照品系P50结茧率为96.15%，P50N3和菊N结茧率与P50呈极显著差异（P<0.01）。
病蚕肠道细菌经过多次分离纯化，显微镜观察球状细菌较多；分子鉴定后获得肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、假单胞菌属（Pseudomonas）和肠杆菌属（Enterobacter）等7类细菌属，其中葡萄球菌属占比（30.00%）最高，其次为肠球菌属和沙雷氏菌属，均为16.67%。
选择分子鉴定一致性最高的8株不同细菌，进一步进行形态学鉴定和生化鉴定，与分子鉴定结果一致。
家蚕的免疫应答与抗病性研究进展
家蚕的免疫应答与抗病性研究进展家蚕是我国重要的经济昆虫之一，世界各国也都十分注重家蚕的研究。
家蚕作为重要的蛋白质资源，在世界范围内具有广泛的应用前景。
但是，家蚕也面临着多种疾病的威胁，例如传染性单核细胞增多症病毒病、家蚕核多角体病、家蚕丝球菌病等。
这些疾病不仅会对家蚕的生长和发展造成影响，也会对家蚕的产业发展造成困扰。
因此，对家蚕的免疫应答和抗病性研究具有重要的理论和应用价值。
一、家蚕的天然免疫系统家蚕的天然免疫系统包括先天免疫和适应性免疫。
其中先天免疫是家蚕在生命早期获取的免疫能力，是一种原始的免疫方式，通过由遗传的或非特异性的机制来抵御环境中的致病微生物。
适应性免疫则是只有在发生感染后才会产生的免疫效应，主要包括T细胞和B细胞的作用。
家蚕的天然免疫系统中，主要包括诸如激活的蛋白酶、缺失的蛋白、自杀基因、小颗粒物和自噬损伤机制等多种反应。
这些反应不仅能够有效地抵御致病微生物的入侵，还能够对损伤和组织修复产生积极的作用。
二、家蚕的免疫应答研究进展在过去的几十年中，家蚕免疫学的研究取得了显著的进展，尤其是在对家蚕免疫应答的研究方面。
科学家们通过对家蚕免疫系统和病毒感染过程的深入研究，发现了许多关键因子，并揭示了家蚕的免疫应答机制。
例如，科学家们发现家蚕中一种名为“家蚕降钙素”的天然抗菌肽具有广谱的抗菌活性，同时具有免疫调节、炎症抑制和细胞凋亡抑制等多种功能。
此外，家蚕中的一种谷氨酸蛋白酶称为"家蚕黑角质蛋白酶"，也是参与家蚕免疫应答的重要因子之一。
家蚕黑角质蛋白酶通过水解异构酶抑制因子来激活免疫反应，同时还参与抗菌、清除自由基和消化碳水化合物等多种生物过程。
此外，家蚕的RNAi和微生物组研究也吸引了科学家们的广泛关注。
研究表明通过RNAi技术可以有效地抑制病毒复制，防止病毒繁殖。
此外，微生物组研究表明家蚕的肠道和体表都寄生着大量的细菌和真菌，家蚕的细菌群落与致病微生物的抗性也有着密切的联系。
家蚕抗菌肽CD高效表达及其抗BmNPV感染作用
第21卷6期中国病毒学21（6）：589-593收稿日期：2006-06-01，修回日期：0000-06-19作者简介：李伟灿（1981-），男，福建省籍，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究。
** 通讯作者：孟小林（1956-），男，山东省籍，教授，从事基因工程药物及昆虫分子病毒学研究。
Corresponding author. Tel: 86-27-68754217, E-mail:Mengxiaolin8@590 中国病毒学第21卷（36aa）。
CD为线形阳离子肽，成熟肽链长36个氨基酸残基，不含半胱氨酸，对大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌如沙门氏菌具有很强的活性，对某些革兰氏阳性菌也有杀伤活性。
天然抗菌肽来源有限，不易分离纯化，无法满足将来医药和科研的需求。
因此采用外源系统实现活性表达很有必要。
国内外均有抗菌肽表达的文献报道[6,7]，但是关于抗菌肽CD 的高效表达及生物活性却未见报道。
本研究成功调取了CD 全长基因，并将编码成熟肽的基因序列成功克隆到表达载体pET32a中，在大肠杆菌BL21中实现了高效融合表达，融合蛋白经肠激酶切割后，分离纯化得到的重组成熟肽，经检验有抑菌和抗BmNPV病毒感染活性。
1 材料与方法1.1实验材料实验用的家蚕来自湖北省农业科学院经济作物研究所，BmNPV提取自病毒感染致死家蚕，经活体感染扩增后提纯，－70 ℃保存。
测活用细菌，金黄葡萄球菌，枯草芽孢杆菌来自湖北省药检所。
克隆载体pGEM-T，反转录酶AMV酶为Promega 公司产品，表达载体pET32a，及大肠杆菌JM109，BL21(DE3) 由本室保存。
RNA提取试剂盒及Ni-NTA亲和层析柱购于 Qiagen公司，超滤管购于Millipore 公司。
Tag DNA聚合酶，T4DNA连接酶及限制性内切酶均购于TAKARA公司，DNA回收试剂盒为Omega公司产品，肠激酶为 Invitrogen 公司产品。
1.2Cecropin D 基因的扩增根据GenBank上登录的CD全长cDNA序列，利用引物设计软件Prime5.0设计调取CD基因全长序列的引物：上游引物(5’-A TGAAA TTCTCGAAAAT TTTCGTT-3’) 下游引物(5’-TCCTTGTCCGAGAGC TTTTGC-3’)。
家蚕BmNPC1蛋白在杆状病毒BmNPV入侵宿主细胞过程中的作用及机制研究
单位代码10635学号012013408000309博士学位论文家蚕BmNPC1蛋白在杆状病毒BmNPV入侵宿主细胞过程中的作用及机制研究论文作者：李致宏指导教师：周泽扬教授李春峰副教授学科专业：微生物学研究方向：应用微生物提交论文日期：2018年5月21日论文答辩日期：2018年6月2日学位授予单位：西南大学中国 重庆2018年6月西南大学二零一八届博士学位论文家蚕BmNPC1蛋白在杆状病毒BmNPV侵染宿主细胞过程中的作用及机制研究学科专业:微生物学研究方向:应用微生物指导教师:周泽扬教授李春峰副教授研究生:李致宏中国·重庆2018年6月Dissertation for Doctoral Degree ofSouthwest UniversityThe role of Bombyx mori Niemann-Pick disease type C(BmNPC1)in baculovirusinfect host cellMajor:MicrobiologyField:Applied MicrobiologySupervisor:Prof.Zeyang ZhouAssociate Prof.Chunfeng Li Candidate:Zhihong LiChongqing,ChinaJune,2018目录目录摘要 (I)ABSTRACT (V)第一章文献综述 (1)1.1NPC1蛋白研究进展 (1)1.1.1NPC1蛋白的结构与功能 (1)1.1.2NPC1蛋白参与胆固醇运输功能的研究历程 (2)1.1.3NPC1蛋白与疾病 (5)1.1.4NPC1蛋白与病毒侵染 (6)1.2杆状病毒的研究进展 (11)1.2.1杆状病毒的分类 (11)1.2.2杆状病毒的生活周期 (12)1.2.3膜融合蛋白与杆状病毒 (14)1.2.4杆状病毒的应用 (16)第二章引言 (19)2.1研究背景 (19)2.2研究目的和意义 (20)2.3主要研究内容 (20)2.3.1家蚕BmNPC1基因的生物信息学分析 (20)2.3.2家蚕BmNPC1的原核表达及定位分析 (21)2.3.3BmNPC1蛋白在BmNPV侵染宿主细胞过程中的作用分析 (21)2.3.4家蚕BmNPC1参与杆状病毒侵染的机制研究 (21)2.4研究技术路线 (22)第三章家蚕Bmnpc1基因的生物信息学分析 (23)3.1材料与方法 (23)3.1.1材料 (23)3.1.2主要方法 (24)3.2结果与分析 (25)3.2.1家蚕BmNPC1的鉴定及序列基本特征分析 (25)3.2.2家蚕BmNPC1的空间结构预测 (27)西南大学博士学位论文3.2.3家蚕BmNPC1的功能域分析 (28)3.2.4家蚕BmNPC1的系统进化分析 (30)3.3结论与讨论 (31)第四章家蚕BmNPC1的原核表达及定位分析 (35)4.1材料与方法 (35)4.1.1材料 (35)4.1.2主要试剂与仪器 (35)4.1.3主要方法 (41)4.2结果与分析 (48)4.2.1家蚕Bmnpc1的CDS扩增 (48)4.2.2BmNPC1蛋白免疫印迹分析 (49)4.2.3家蚕BmNPC1的定位研究 (50)4.2.4家蚕BmNPC1蛋白膜外区多克隆抗体制备 (51)4.3结论与讨论 (55)第五章BmNPC1在杆状病毒BmNPV侵染宿主中的作用分析 (59)5.1材料与方法 (59)5.1.1材料 (59)5.1.2主要试剂与仪器 (59)5.1.3主要方法 (61)5.2结果与分析 (67)5.2.1NPC1抑制剂对BmE细胞的毒性分析 (67)5.2.2NPC1抑制剂对杆状病毒在BmE细胞中增殖的影响 (68)5.2.3BmNPC1干涉载体的构建及抑制Bmnpc1转录的分析 (70)5.2.4干涉载体的表达对杆状病毒在BmE细胞中增殖的影响 (71)5.2.5敲除BmNPC1细胞的构建及鉴定 (74)5.2.6敲除BmNPC1的细胞对杆状病毒增殖的影响 (75)5.3结论与讨论 (77)第六章家蚕BmNPC1参与杆状病毒侵染的机制研究 (79)6.1材料与方法 (79)6.1.1材料 (79)6.1.2主要试剂与仪器 (79)6.1.3主要方法 (82)6.2结果与分析 (89)6.2.1免疫共沉淀分析家蚕BmNPC1和杆状病毒GP64之间的互作 (89)6.2.2酵母双杂交分析BmNPC1与GP64蛋白之间的相互作用 (97)6.2.3家蚕BmNPC1与杆状病毒BV之间的定位分析 (103)6.2.4家蚕BmNPC1的抗体封闭对杆状病毒BV侵染宿主细胞的影响 (105)6.2.5杆状病毒侵染宿主细胞的侵染模型 (108)6.3结论与讨论 (109)第七章综合与讨论 (113)7.1家蚕Bmnpc1基因序列的生物信息学分析 (113)7.2家蚕中BmNPC1的原核表达及定位分析 (113)7.3杆状病毒BmNPV的侵染依赖于BmNPC1蛋白 (114)7.4家蚕BmNPC1参与杆状病毒BmNPV侵染的机制研究 (114)论文的创新点 (117)参考文献 (119)在读期间发表的文章及参研课题 (131)附录 (133)致谢 (142)家蚕BmNPC1蛋白在杆状病毒BmNPV侵染宿主细胞过程中的作用及机制研究微生物学博士研究生李致宏指导教师周泽扬教授李春峰副教授摘要C型尼曼-匹克病（Niemann-Pick disease type C，NPC）是一种致命的神经内脏脂质沉积病，其最显著的异常细胞表型为游离胆固醇沉积于溶酶体内，导致胆固醇从溶酶体向细胞内其他部位的运输障碍。
BmCPV受体蛋白的筛选鉴定及家蚕翅原基发育的分子机制研究中期报告
BmCPV受体蛋白的筛选鉴定及家蚕翅原基发育的分子机制研究中期报告本研究旨在筛选和鉴定家蚕(Bombyx mori)细胞中与BmCPV(Cricket paralysis virus)感染相关的受体蛋白，并探索其在家蚕翅原基发育过程中的影响及分子机制。
在前期研究中，我们通过体外感染实验和双向蛋白质互作筛选，在家蚕BmN细胞中筛选出了多个与BmCPV感染相关的受体蛋白。
接着，我们通过RNA干扰技术，分别对这些受体进行了敲降实验，并利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法，测定了它们在BmCPV感染过程中的表达变化及其对病毒感染的影响。
结果表明，细胞膜上的一种糖蛋白(sugar protein)在BmCPV感染过程中起重要作用，其敲降能显著减少病毒感染率和复制速度。
为了进一步阐明这种糖蛋白对家蚕翅原基发育的影响，我们设计了一系列实验，包括in vivo和in vitro模型的建立和细胞信号通路的分析等。
我们通过原基培养和组织形态学分析，发现糖蛋白敲降显著抑制了家蚕翅原基的生长和发育。
同时，我们又利用Western blotting和免疫荧光染色等方法，探究了这种糖蛋白与相关信号分子的相互作用及其对家蚕翅原基发育的影响。
初步结果表明，糖蛋白可能通过介导Wnt/beta-catenin 和Notch信号通路的活化或抑制，参与调节家蚕翅原基发育过程中的细胞增殖、分化和命运决定。
综上，本中期报告为我们今后进一步深入阐明家蚕BmCPV感染和家蚕翅原基发育的分子机制提供了有力支持。
我们将继续完善研究设计，进一步揭示其内部联系和生物学意义，为病毒学和发育生物学领域的研究提供新思路和新方法。
抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究
抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究李龙;孙慧;刘泽玉;徐安英;钱荷英;武国华【摘要】[Objective]To study the separation methods of copper compounds related to BmNPV resistance in hemolymph of Bombyx mori.[Method]B.mori cultivars with and without BmNPV resistance were selected as research objects to feed BmNPV virus.Cu compounds was extracting and determinated from hemolymph of two groups B.mori by SEC-ICP-MS.[Result]The optimal seperation conditions for size exclusion chromatography were as follows:YarraTM SEC-2000,30 mmol/L Tris-acetic acid(pH 7.4) as mobile phase, flow rate of 0.5 mL/min.SEC-ICP-MS technology for separating and detecting copper compounds in hemolymph of B.mori was established.The main differences of copper compounds between resistant cultivars of B.mori and non-resistant cultivars of B.mori was the compounds with the retention time of 7.6 min.[Conclusion]The separation liquid of hemolymph of Bombyx mori might be related with BmNPV resistance seperated and collected by glucan G100 gel column was prepared.The research can provide simpler and more effective methods for the seperation of metal proteins inB.mori.%[目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法.[方法]选取对 BmNPV 具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象,对它们进行添食BmNPV 病毒处理.提取家蚕的血淋巴,运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测.[结果]筛选出优化的体积排阻色谱分离条件:YarraTM SEC-2000分离柱,30 mmol/L Tris-醋酸为流动相(pH 7.4),流速0.5 mL/min.建立了分离与检测家蚕血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS联用技术.BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分.[结论]制备了葡聚糖G100凝胶柱分离并收集可能与BmNPV 抗性相关的家蚕血液分离液,为家蚕金属蛋白的分离提供更简便有效的方法.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)020【总页数】6页(P111-116)【关键词】家蚕;BmNPV;抗性;体积排阻色谱;电感耦合等离子体质谱【作者】李龙;孙慧;刘泽玉;徐安英;钱荷英;武国华【作者单位】江苏科技大学蚕业研究所,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江 212018;江苏科技大学蚕业研究所,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江212018;江苏科技大学蚕业研究所,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江 212018;江苏科技大学蚕业研究所,江苏镇江 212018;农业部蚕桑产品及食用昆虫质量安全风险评估实验室,江苏镇江 212018【正文语种】中文【中图分类】S881.2蚕丝产业在我国已有5 000多年的历史，长久以来为中华民族文化、经济和社会发展做出了重大贡献[1]。
家蚕质多角体病毒(BmCPV)的结构研究
家蚕质多角体病毒(BmCPV)的结构研究
余学奎;张勤奋;张景强
【期刊名称】《电子显微学报》
【年(卷),期】1998(17)4
【摘要】家蚕质多角体病毒（ＢｍＣＰＶ）的结构研究＊余学奎卢火斤英张勤奋张景强（中山大学昆虫学研究所，生物防治国家重点实验室，广州５１０２７５）＊国家自然科学基金重点项目资助质多角体病毒（ＣＰＶ）属于呼肠弧病毒科。
已在２００多种昆虫中发现有ＣＰＶ感染。
ＣＰＶ在...
【总页数】2页(P389-390)
【关键词】家蚕;质多角体病毒;BmCPV;电镜
【作者】余学奎;张勤奋;张景强
【作者单位】中山大学昆虫学研究所生物防治国家重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S884.51
【相关文献】
1.家蚕感染质型多角体病毒(BmCPV)后中肠组织差异蛋白质分析 [J], 高坤;邓祥元;裘智勇;覃光星;郭锡杰
2.家蚕质多角体病毒(BmCPV)结构研究 [J], 余学奎;卢炘英;张红;周正洪;张勤奋;张兴;张景强
3.克孢灵对家蚕质型多角体病病毒粒子灭活作用的探讨研究 [J], 郑燕
4.家蚕四角形核型多角体病毒的研究(Ⅳ)多角体的结构及化学组成 [J], 贡成良;卢铿明
5.家蚕质多角体病毒(BmCPV)基因组dsRNA片段V的全序列测定 [J], 林伟;徐安龙;杨文利;孙京臣;卢火斤英;张景强
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利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探
一、总则为了加强沉香种植病害的管理，保障沉香产业的健康发展，提高沉香种植的效益，特制定本制度。
二、适用范围本制度适用于我国境内所有沉香种植基地、企业、个体户以及相关管理部门。
三、病害分类1. 生理性病害：由环境、营养、水分等因素引起的病害。
2. 病理性病害：由病原菌、病毒、线虫等引起的病害。
四、病害防治原则1. 预防为主，综合防治。
2. 以农业防治为基础，生物防治、化学防治相结合。
3. 严格执行国家关于农药、化肥使用的法律法规，确保产品质量和安全。
五、病害监测与报告1. 建立沉香种植病害监测网络，定期对种植基地进行病害监测。
2. 发现疑似病害，应及时进行样本采集，送检鉴定。
3. 确诊病害后，及时向当地农业部门报告，并采取措施控制病害蔓延。
4. 定期发布病害监测报告，为种植户提供防治指导。
六、病害防治措施1. 农业防治：a. 选择抗病、抗逆性强的沉香品种；b. 优化种植布局，合理密植；c. 加强田间管理，保持土壤水分和养分平衡；d. 清除病残体，减少病原菌传播。
2. 生物防治：a. 利用天敌昆虫、微生物等生物防治方法；b. 培育和推广抗病品种；c. 实施生物防治与化学防治相结合的策略。
3. 化学防治：a. 选用高效、低毒、低残留的农药；b. 严格按照农药使用说明进行施药；c. 交替使用不同类型的农药，避免病原菌产生抗药性。
七、病害防治责任1. 种植户应按照本制度规定，采取有效措施防治病害；2. 管理部门应加强对沉香种植病害的监测和防治指导；3. 农业技术推广部门应提供技术培训和咨询服务；4. 药品经营企业应提供合法、合规的农药产品。
八、监督检查1. 当地农业部门负责对本制度执行情况进行监督检查；2. 对违反本制度的行为，依法予以查处。
九、附则1. 本制度自发布之日起施行；2. 本制度由当地农业部门负责解释。
本制度旨在规范沉香种植病害管理，提高沉香产业效益，为我国沉香产业发展提供有力保障。
各相关部门和单位应认真贯彻落实本制度，共同推动沉香产业的健康发展。
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BmBDV、BmCPV反向遗传学系统的建立及不同抗性家蚕对BmCPV
的感染应答
家蚕浓核病毒(Bm BDV)能特异性地侵染家蚕中肠组织的柱状细胞,是家蚕软化病的病原。
Bm BDV的基因组由两种不同的单链DNA,VD1(6,543 nts)和
VD2(6,022 nts)构成,病毒粒子中只含有两种DNA分子中的一种。
目前还没有一种细胞系可感染Bm BDV,也不能通过基因操作改变Bm BDV的基因研究病毒基因的功能。
家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)基因组由10个分节ds RNA片段组成,每个ds RNA片段含有一个完整的开放阅读框(ORF)。
由于Bm CPV为ds RNA,且缺乏Bm CPV的敏感细胞系,无法通过基因敲除或敲入研究Bm CPV基因功能,导致Bm CPV基因功能研究几无进展。
不同的家蚕品种对Bm CPV的抗性存在差异,但品种间的抗性差异机制仍有许多不明之处。
基于目前的研究现状和存在问题,我们开展了基于Bm BDV基因组DNA质粒拯救病毒研究、基于体外转录的病毒RNA转染细胞拯救Bm CPV研究,期望为Bm BDV 和Bm CPV基因的功能研究提供新的系统;同时,利用RNA-Seq技术,研究了不同抗性品种家蚕感染Bm CPV后,中肠组织基因组转录水平的变化,期望为理解家蚕对Bm CPV的感染应答及抗Bm CPV的分子机制提供新的线索。
1、Bm BDV反向遗传学系统的研究为了提供Bm BDV基因功能的研究平台,将含有Bm BDV VD1基因组的重组质粒p GEM-VD1转染家蚕卵巢(Bm N)细胞,发现细胞表现出明显的细胞病变;Western blotting与免疫荧光皆能检测到Bm BDV基因的表达。
同时,我们通过Bac-to-Bac载体表达系统构建了装载VD1全基因组的重组杆状病毒Bm Bac-VD1,该重组病毒基因组DNA转染Bm N培养细胞,可观察到细胞出现明显病变,将培养上清转接正常Bm N细胞,表现出相同的病变;Western
blotting与免疫荧光试验可检测到Bm BDV病毒结构蛋白的表达;透射电镜可同时观察到球形病毒粒子与杆状病毒粒子,通过差速离心将两种病毒粒子分离,分子生物学鉴定结果显示,球形病毒样颗粒中包裹有重组病毒基因组。
上述结果显示,通过基于病毒基因组的质粒DNA可以拯救出Bm BDV,通过杆状病毒装载VD1全基因组可获得Bm BDV样的病毒颗粒,表明我们已建立了Bm BDV的反向遗传学系统,为通过基因缺失或突变的方式研究Bm BDV的基因功能提供了平台。
2、Bm CPV反向遗传学系统的研究利用片段搭桥和同源重组等方法对Bm CPV 基因组10个分节ds RNA片段的全长c DNA进行了克隆,并用T7启动子分别控制10个分节ds RNA片段的全长c DNA,克隆进p IZT-V5/His载体,获得了重组质粒p IZT-CS1—p IZT-CS10。
同时,用Ds Red基因替换Bm CPV S10片段c DNA中的多角体蛋白基因的开放读码框(ORF),构建了重组质粒p IZT-CS10(Ds Red)。
以线性化的p IZT-CS1—p IZT-CS10为模板,体外转录成Bm CPV10个基因组片段的RNA,转染家蚕培养细胞,发现转染细胞表现出发病症状;Western blotting和免疫荧光能够检测到Bm CPV基因的表达蛋白;Real-time PCR结果显示,转染细胞中Bm CPV基因的明显上升,说明体外转录的病毒基因组片段的RNA 转染家蚕培养细胞可拯救出具有复制能力Bm CPV;进而,将Bm CPV S1-S9片段的体外转录RNA与p IZT-CS10(Ds Red)为模板的体外转录RNA共转染家蚕Bm N细胞,6天后将转染细胞的培养上清转接正常细胞,转接细胞发出红色荧光,随着培养时间的延长,荧光细胞的比例逐渐增大,说明S10片段为Bm CPV复制必须片段,病毒衣壳蛋白识别包埋S10片段的位点位于非编码区。
上述结果表明,通过建立的基于体外转录的病毒基因组片段的RNA转染家蚕培养细胞拯救Bm CPV系统可以用于研究Bm CPV的基因功能,可通过将外源基因导入Bm CPV基因组的复制非
必须片段构建重组Bm CPV表达外源基因或通过类似策略研发重组CPV生物杀虫剂。
3、不同抗性家蚕品种感染家蚕质型多角体病毒的中肠组织比较转录组学研究为了探讨品种间Bm CPV的抗性产生机制,我们通过RNA-Seq测序技术,比较分析了家蚕蓝5(Lan5,Bm CPV易感品种)和欧17(Ou17,Bm CPV抗性品种)感染家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)后中肠组织的基因表达谱。
测序结果显示,在感染的Lan5、Ou17中肠组织中,上调表达基因数量分别为330和218个,而下调表达基因数量分别为147和260个。
我们对Lan5与Ou17中肠组织差异表达基因(DEGs)进行了GO(Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)富集分析,并利用STRING数据库分析了Lan5与Ou17中肠组织共同上调/下调基因的相互作用。
结果显示,部分共同差异表达基因相互作用并形成网络,在共同上调表达基因中,表皮蛋白Cpr62Bc和微型染色体维持蛋白5(DNA复制许可因子Mcm5)的作用至关重要,而在共同下调基因中,热激蛋白23(Hsp23)的作用最为关键。
研究结果为进一步探讨家蚕抵抗Bm CPV病毒侵染的免疫机制、明确不同家蚕品种的抗性差异提供了新的线索,也为深入研究其中的关键基因奠定了基础。