151125诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。
NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。
2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。
诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。
与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。
学校及托幼机构诺如病毒感染性腹泻调查处理指引
学校及托幼机构诺如病毒感染性腹泻疫情处置指引一、学校、托幼机构主要工作内容学校及托幼机构在未出现疫情时应根据《指引》要求做好日常防控工作，一旦出现聚集性或暴发疫情时，应及时向辖区疾控机构和社区卫生服务中心报告。
在疫情调查处置阶段成立传染病防控小组，明确个人分工，配合辖区疾控中心和社区卫生服务中心开展流行病学调查、病例搜索及报告、病例隔离和环境消毒等工作。
学校、托幼机构作为疫情发生单位是负责控制措施落实的主体责任者，主要工作内容如下：（一）病例管理（二）外环境消毒（三）食品安全管理（四）水卫生管理（五）配合疾控中心工作人员做好疫情处置相关工作（六）暂停聚集性活动（七）开展健康教育二、疫情处置措施（一）病例管理工作1. 加强晨、午检校医或保健老师每天早晨学生进入学校前开展晨检工作。
对于报告有腹泻、呕吐等症状的学生应及时登记并录入晨检系统，- 2 -并通知病例进行停课隔离。
疫情严重期间，学校须增设午检。
疫情发生期间每天上班前询问职工身体健康状况并登记，如出现呕吐或腹泻应立即调离岗位并隔离治疗。
学校托幼机构学生健康监测日报表见附件1。
2. 做好因病缺勤登记工作各班级或年级安排专人进行因病缺勤登记，并设置因病缺勤登记本，及时了解学生缺勤原因，并跟踪其疾病进展及恢复状况。
学生因病缺课情况每日登记表参考附件2。
3. 病例隔离病例均应暂停上课，隔离期为症状完全消失后72小时。
轻症患者可居家隔离治疗，症状重者需送医院按肠道传染病隔离治疗。
寄宿学校须划分足够的独立区域对病例进行隔离。
隔离宿舍设置指引见附件3。
4. 病例日报及零报告疫情发生期间，校方须实施病例日报及零报告制度。
校内病例汇总可按照班级—年级—学校的方式逐级上报，最后汇总至校医室或学校其它指定人员，于当日10时前将病例一览表上报至区疾控中心。
病例为零时亦须逐级、按时上报。
进行病例登记时应按照病例一览表要求进行信息填报，搜索到的病例应及时隔离。
诺如病毒感染性腹泻暴发调查病例一览表见附件4。
广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引
附件9广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引诺如病毒的实验室检测方法主要包括核酸检测和抗原检测，核酸检测是目前国际上最常用的检测方法。
这些方法各有优缺点，在操作时可根据技术水平、经济条件和使用目的进行选择，对于检测结果应参照临床症状和流行病学特征进行分析。
一、标本处理（一）粪便将1ml PBS加入至1.5ml EP管或2ml 螺口管中，再加入0.1g 固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清，制成10%的便悬液，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
注意便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。
（二）肛拭子旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（三）呕吐物臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min 离心30min，吸上清，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（四）环境涂抹标本经旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
二、标本检测（一）核酸检测- 38 -1.核酸提取目前有多种商业试剂可用于粪便等标本的核酸提取，可用病毒RNA提取试剂，也可用RNA&DNA总核酸提取试剂，具体提取方法按照试剂说明书。
采用总核酸提取试剂，在使用逆转录聚合酶链反应扩增核酸时容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性，因此以RNA提取试剂为佳。
核酸提取完成后，尽快放入冰箱保存，如果3天内开展核酸检测，10℃以下保存即可，超过这个时间需放入-70℃冰箱保存。
注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。
2．荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)本方法是诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。
病毒性腹泻检测技术2011
病毒性腹泻标本的处理和病原检测方法一、标本的处理制备10％的便悬液：将粪便标本加到1.5mlEP管中，加入标本处理液，震荡3次，每次10秒。
然后静臵10分钟，再以8千转/分钟离心5分钟，吸取上清进行下一步试验或-20℃短期保存。
二、轮状病毒ELISA检测采用ProSpect轮状病毒ELISA检测试剂盒，详细事宜请参考试剂盒说明书。
（一）检测前：1将试剂和待检测标本臵于室温（15～30℃）30min。
2每次检测均至少一个阳性对照和一个阴性对照。
3空白对照：空气4洗液的配制：1倍体积的洗液浓缩液（WASH BUFFER×10）加9倍体积的去离子水，当天用当天配。
（二）检测步骤：1将需要数量的微孔板臵于微孔板架上。
2每孔加入100µl 10％便悬液以及阴性对照，阳性对照。
3每孔加入2滴（或100µl）酶结合物（conjugate），轻微震荡混匀或用枪头轻柔混匀（上下5次左右），20～30℃静臵60±5min。
4每孔加入350～400µl洗液（用手轻微摇动1 min左右），弃去洗液，在卫生纸上拍干，共洗5次。
5每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃静臵10min。
待蓝色显现后迅速观察颜色。
6每孔加入2滴（或100µl）终止液（Stop solution），充分混匀。
7读取OD450值，打印输出或记录值。
结果必须在加入终止液后30min内读取。
8如果酶标仪有参考波长620nm或630nm可供使用，最好使用双波长检测。
（三）结果判定：1阴性对照：肉眼观察无色或OD450值<0.15。
2阳性对照：肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。
3临界值（cut-off value）＝阴性对照OD450值平均值＋0.10。
4标本：a)肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性，肉眼观察无色判定为阴性。
b)OD450值>临界值＋0.01判定为阳性，<临界值－0.01判定为阴性，OD450值在临界值±0.01范围内判定为可疑，应重复检测或重新取样。
诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
样品到达实验室后，应立即进行检测，避 免样品长时间保存导致检测结果不准确。
2
检测技术
实时荧光定 量PCR技术： 快速、准确、
灵敏度高
酶联免疫吸 附试验：操 作简便、成 本低、灵敏
度高
核酸杂交技 术：特异性 强、灵敏度 高、操作简
消毒方法：使用含氯消毒 剂、紫外线消毒等
消毒频率：根据疫情严重 程度和消毒效果调整
注意事项：避免消毒剂残 留，做好个人防护
结果分析
01
检测结果：阳性、阴性、可 疑
03
阴性结果：表明样品中不存 在诺如病毒
02
阳性结果：表明样品中存在 诺如病毒
04
可疑结果：需要进一步检测 以确定是否存在诺如病毒
3
个人卫生
1
勤洗手：饭前 便后、接触公 共物品后要洗
手
2
保持社交距离： 避免密集场所， 保持社交距离
3
佩戴口罩：在 公共场所佩戴 口罩，防止飞
沫传播
4
加强锻炼：增 强体质，提高
免疫力
食品卫生
保持食品清洁： 避免食物受到
污染，防止细 1
菌滋生
保持厨房卫生： 4
保持厨房清洁， 定期消毒，防 止细菌滋生
生熟分开：生 熟食品分开处
2 理，避免交叉
污染
3 彻底煮熟：食
物要彻底煮熟， 避免细菌残留
环境消毒
消毒范围：患者接触过的 物品、环境、衣物等
采集方法
01
采集时间：发病后24小时内
02Leabharlann 采集部位：粪便、呕吐物、肛拭子等03
采集工具：无菌棉签、无菌容器等
最新深圳感染性腹泻病原谱哨点监测工作方案版
深圳市感染性腹泻病原谱哨点监测工作方案（2015版）感染性腹泻是我市急性传染病中发病数最多、流行面最广、影响群众生活生产的一组疾病。
其中霍乱虽得到有效控制，但每隔几年仍会有散发病例出现；伤寒副伤寒、细菌性痢疾的发病数和发病率一直位居全省前列；而其它感染性腹泻病发病数也一直居高不下，常年位居所有传染病的首位或第二位，所引起的暴发疫情也不断出现，疫情防控压力仍较大。
鉴于感染性腹泻包含众多病种且病原更为复杂多样，单纯的症状监测和单一的腹泻病原监测体系已难以适应当前防控工作的需要，为进一步完善重点肠道传染病监测预警系统，及时有效处置感染性腹泻暴发疫情，遏制肠道传染病高发态势，结合深圳实际，特制定本方案。
一、目的（一）建立以实验室为基础的感染性腹泻病原谱监测网络，了解深圳市感染性腹泻的病原谱构成，追踪病原谱变迁趋势，探明病原毒力因子。
（二）构建病原菌分子分型数据库，并结合病例流行病学资料和病原学资料为暴发疫情的早期预警预测提供基础数据，探索一种更灵敏的疾病监测模式。
（三）协助早期识别特定感染性腹泻的暴发疫情，分析流行因素，引导对重点地区和人群的主动监测。
（四）对菌株进行抗菌药物敏感性监测，指导临床合理的治疗和预防用药。
（五）促进临床实验室和公共卫生实验室数据的交流。
（六）为食品安全微生物风险评估提供疾病监测的本底数据。
二、工作内容（一）细菌性腹泻监测。
1.监测病例的纳入标准。
（1）每日排便3次或以上，且大便性状有改变呈稀便、水样便、粘液便或脓血便等。
（2）监测病例的排除标准：符合下列标准中的其中一条即可排除。
①已经使用抗生素的患者（针对细菌性腹泻）；②不恰当服用化学物质、食用毒蕈等所导致的腹泻患者；③可以明确诊断为阿米巴痢疾等寄生虫性腹泻的病例；④慢性腹泻超过2周的病例。
2.监测内容。
（1）标本数量和采样要求。
哨点医院采集门诊腹泻/腹泻住院病例急性期（发病3日内）的粪便样本（包括肛拭子）或呕吐物进行致病菌的分离培养。
广东省诺如病毒感染性腹泻暴发现场调查收集信息一览表
附件3广东省诺如病毒感染性腹泻暴发现场调查收集信息一览表需收集资料已收集的请填一般情况社区基本信息（位置、面积、自然村、人数等）单位（学校）基本信息（单位名称、成立时间、性质、地点）各部门（班级）的花名册若无花名册，则需各部门（班级）的名称和人数部门（班级）的楼层分布单位（学校）内、外住宿人数宿舍楼数量和名称宿舍房间的楼层分布每个宿舍房间住宿人数近期天气异常（如长期暴雨）或灾害（如内涝）情况其它：病例搜索和个案调查辖区内的其它集体单位是否发生类似疫情辖区内医疗机构/医务室近2个月每日腹泻病例数、就诊总人数近一个月学生缺勤登记近一个月教师考勤记录近一个月厨工考勤记录近一周是否有厨工发生呕吐、腹泻等胃肠道症状病例调查个案表和一览表（手机、宿舍务必登记！务必区分是否现症病例和轻/重症）病例血常规检测结果，有检测的全部收集其它：食品卫生单位供餐方式食堂的数量和名称每个食堂用餐人数/打卡记录近一周内每餐食谱备餐流程食堂用水来源厨工调查一览表其它：- 20 -需收集资料已收集的请填水卫生生活用水来源及使用情况本单位生活用水管网分布图饮水来源及使用情况桶装水分配记录社区供水管网图（标记与该单位相同分支供水管线上的集体单位）自来水处理工艺流程（重点是何种方式加氯，加氯的频次，每次加氯的量）直饮水处理工艺流程（重点是过滤器使用时间、过滤膜更换记录及维护记录）最近一个月社区/单位供水管网维修记录最近一个月学校内各类生活用水的水质检测报告相同供水区域内集体单位是否发生类似疫情其它：环境卫生教室、宿舍、食堂、厕所等场所及外周环境通风及清洁卫生现况洗手液或肥皂、洗手设施等配备及使用情况场所被病例粪便、呕吐物污染情况现场清洁消毒情况其它：个人防护护理人员的防护及清洁消毒情况清洁人员的防护及清洁消毒情况其它：- 21 -。
诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案PPT课件
• 1.2.1 设备和材料
• DEPC 水、新配制次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、
MilliporeHA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空
泵、计时器、PH 值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰
箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100K columns（PALL
公司）、Centriprep YM-50（Millipore 公司）、洗脱液
9
1 标本前处理
• 1.2.2.2 水样品的过滤
• （1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻 关闭真空泵。
• （2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度 漏斗。
• 1.2.2.3 用酸漂洗滤膜
• 将膜用无菌的镊子夹放在有200ml 0.05mM H膜2去SO除4（Mgp2H+3。.0）的无菌500ml 烧杯中进行漂洗滤
5
1 标本前处理
离心5 分钟，使得固体沉淀。澄清上清液可以直 接用于病毒核酸提取或贮存于-70℃。 • （3）取澄清的上清液200ul 进行RNA 提取。
6
1 标本前处理
• 1.2 水
• 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含 0.05M 甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使 用Microsep 100TM 或CentriconTM columns 离心管进一 步浓缩便、呕吐物
1.2 水
1.3 环境涂抹样
1.4 食品
1.4.1贝类
1.4.2三文鱼
1.4.3草莓、蓝莓
1.4.4生菜和苗芽菜
4
1 标本前处理
• 1.1 粪便、呕吐物 • 1.1.1 设备和材料
微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离 心机、1.5ml 无菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液 （PBS）10mM pH7.0-7.4。 • 1.1.2 操作方法 • （1）离心管每管分装0.5mlPBS。用一次性移液 管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 克），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪 便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS 中稀释，直接使用500ul 的样品。 • （2）漩涡振荡每个样品1 分钟。在5000 rpm 下
水样本中腹泻病毒检测
病毒回收效率
浓缩浓度
10%便悬液 1%便悬液 0.1%便悬液 0.01%便悬液
便悬液 结果Ct1
25.63 28.86 32.05 35.11
浓缩后
大体积结果 中体积结果
Ct2'
Ct2
28.29
25.42
回收率 21%-34%
平均回收率
31.31 34.67
28.59 31.75
21%-35% 21%-36%
主要内容
背景 水样浓缩富集方法 实验方法 仪器介绍
背景
• 1988年上海甲型肝炎流行：30万人暴发甲型肝炎病毒感 染，由于食用遭甲型肝炎病毒污染水体中养殖的毛蚶造 成；
• 1991印度戊型肝炎流行：印度坎普尔由于使用了被戊型 肝炎病毒污染的饮用水造成7.9万人感染戊型肝炎；
• 2014年11月，山东滨州一高校发生1614名学生不明原因 腹泻流行，经调查证实为诺如病毒污染直饮水所致；
3. 膜处理 使用无菌剪刀将滤膜尽可能 剪成碎片，用无菌镊子将所 有滤膜碎片移至一个2mL离 心管中。向2mL离心管中加 入0.3-0.4mL（病毒洗脱液刚 好浸过滤膜碎片）病毒洗脱 后，调节高效混匀器的转速 为第5-6档（转速约为2500 rpm），振荡5 min。液体和 剪碎的膜留作病毒核酸提取。
51.50%
36.68
34.47 64%-100%
1、10%便悬液检பைடு நூலகம்Ct值为25.63，将该10%便悬液10倍梯度稀释。 2、每份待加标便悬液取200ul用于核酸提取，同时向水样中加入 200ul不同浓度的便悬液。 3、大体积仅处理1/8膜，实际Ct值应-3 4、回收率推导公式：(1＋E)(ct1-ct2)×100%，E值扩增效率默认为
感染性标本的采样、储存、运输的具体操作方法
感染性标本的采样、储存、运输的具体操作方法所有的采样工作都必须根据疾病的特点，在严格做好防护的基础上进行。
常见传染病需采集的标本见表1（一）呼吸道标本的采集（如不明原因肺炎）1．采样器材拭子、压舌板、塑料瓶、采样杯或器皿、15ml 的离心管、移液管、注射器、10ml真空取血管、冰壶、采样运输管、有生物安全标志或标有“感染性物质”的外包装容器（见图1）；其他：酒精灯、剪刀、纸漏斗、酒精、碘酒、吸耳球、塑料袋、记号笔、标签、登记表等。
2．采集方法（1）鼻拭子（上呼吸道）：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭两侧鼻孔。
将棉签浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去。
然后，塞紧或盖好管盖。
（2）咽拭子（上呼吸道）：用棉签用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（见图2），同样将棉签头浸入4-5 ml采样液的管中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
（3）鼻洗液（上呼吸道）：患者取坐姿，头稍后仰，用移液管将5ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭鼻腔。
然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程洗两侧鼻孔。
（4）鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物（下呼吸道）：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取气管和支气管分泌物。
先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。
近来国内有用小孩导尿管接在50 ml注射器上来替代收集器。
（5）漱口液：用10 ml采样液漱口。
漱时让患者头部微后仰，发噢声，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集漱液。
注：取漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有，含漱液中不应含抗菌素。
（6）肺活检材料：肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。
NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。
2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。
诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。
与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。
诺如病毒腹泻防控与监测
诺如病毒腹泻防控与监测腹泻病其他感染性腹泻定义：除霍乱、痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻。
可由病毒、细菌、真菌、原虫等多种病原体引起。
为《中华人民共和国传染病防治法》中规定的丙类传染病。
其它感染性腹泻病发病数在丙类传染病中居第二位。
病毒性腹泻病毒性腹泻（Viral Diarrhea），又称病毒性胃肠炎（Acute Gastroenteritis），是一组由多种病毒引起的急性肠道传染病。
临床特点为起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，排水样便或稀便，也可有发热及全身不适等症状，病程短，病死率低。
各种病毒所致胃肠炎的临床表现基本类似。
病毒性腹泻病原体（不同属）轮状病毒：呼肠孤病毒科轮状病毒属人杯状病毒：杯状/嵌杯病毒科诺如病毒属扎如病毒属肠道腺病毒：腺病毒科哺乳动物腺病毒属人星状病毒：星状病毒科哺乳动物星状病毒属诺如病毒的发现过程1929年，Zahorsky提出“冬季呕吐病”（“Winter vomiting disease”）；20世纪40年代, Gordon 及同事将胃肠炎暴发病人的粪便样本过滤后, 接种给志愿者，导致志愿者发病；1968年, 美俄亥俄州诺瓦克镇一所小学暴发急性胃肠炎，1972年Kapikian及同事利用免疫电镜发现了病毒颗粒，命名为诺瓦克病毒（Norwalk virus），小圆结构病毒（small round structured viruses)；世界各地陆续发现类似的病毒，统称为诺瓦克样病毒（Norwalk like viruses）美籍华人Jiang Xi，首次克隆基因组，首次RT-PCR检测，首次全基因组测序2002年，第八届国际病毒命名委员会批准名称为Norovirus，大陆和香港均将之译为“诺如病毒”，台湾将之译成“诺罗病毒”。
病原学RNA病毒，易变异。
诺如病毒可分为6个基因组（GI-GVI），其中GⅠ、GⅡ、GⅣ组感染人，GⅠ组也可感染猪，GⅢ和GⅤ组分别感染牛和鼠。
诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
二、采集要求
粪便、带便肛拭子和呕吐物 粪便可用便盒采集 肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBS液
后，插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm）处，轻轻旋转擦取 直肠表面带便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。 呕吐物可注入灭菌容器内 采集的最优时间在发病后48-72小时内 采集量3g/3ml左右 采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部 被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。 样本采集后，立即冷藏保存。
年龄，发病时间、采集时间等 附件8和附表8-1
二、厨工
食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好） 或带便肛拭子标本
涉疫单位的厨工人数在30人以下，全部采样； 30人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作， 从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期 出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集30人。
诺如病毒感染性腹泻 样品采集与检测
广东省疾病预防控制中心 （2015年11月25日）
主要内容
■不同类型标本的采集要求 ■样品采集、运输和保藏 ■诺如病毒检测方法及结果分析
原则 不同类型标本的采样原则
一、病例
根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点 病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病 厨工、重点岗位的病例等的标本；
呕吐物 置于漩涡震荡器充分混匀，4 ℃,≥5000r/min 离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清 ，立即检测或置-20℃冰箱保存备用。
标本检测——核酸检测
核酸提取（多种商业试剂，如Qiagen、罗氏等） 病毒RNA提取试剂（推荐） 病毒总核酸提取试剂
对所有腹泻病人需要采集的标本
对所有腹泻病人需要采集的标本
正确的标本采集和及时送检是保证胃肠道感染细菌学检验质量的关键。
采集前首先考虑适应证,没有适应证不必送检。
采集时应注意以下几点：
(1)粪便样本中不应混入尿液及其他异物，采集过程应尽量无菌操作。
(2)不应用厕纸收集粪便。
(3)粪便艰难梭菌培养应用10 ml无菌带盖塑料管留取2/3量以上且应尽快送检。
(4)同一患者在同一天不宜重复送检。
(5)尽可能在抗菌药物使用之前收集标本。
(6)宜在感染急性期（通常5~7天内）采集标本。
(7)下列腹泻患者应连续3天送检标本：①社区获得性腹泻（人院前或72小时内出现症状)。
②医院内腹泻（入院72小时后出现症状），且至少有下列情况之一：大于65岁并伴有内科疾病、HIV感染、粒细胞缺乏症（中性粒细胞<0.5x109/ml)及疑似院内暴发。
③怀疑肠道感染的非腹泻性表现。
(8)肠炎和发热患者建议做血培养。
(9)伤寒沙门菌感染时骨髓培养检出率高于血培养。
标本的采集和运送具有重要意义，其质量直接关系到检验结果的可靠性。
标本的采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前，在不同时间采集2~3份新鲜标本送检，以提高胃肠道感染的病
原检出率。
诺如病毒检验（食品微生物学检验）
诺如病毒检验（食品微生物学检验）食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(N o r o v i r u s)的实时荧光R T-P C R检测方法三本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜二瓜二坚果等硬质表面食品,草莓二西红柿二葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测三2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光P C R仪三2.2冷冻离心机三2.3无菌刀片或等效均质器三2.4涡旋仪三2.5天平:感量为0.1g三2.6振荡器三2.7水浴锅三2.8离心机三2.9高压灭菌锅三2.10低温冰箱:-80?三2.11微量移液器三2.12p H计或精密p H试纸三2.13网状过滤袋:400m L三2.14无菌棉拭子三2.15无菌贝类剥刀三2.16橡胶垫三2.17无菌剪刀三2.18无菌钳子三2.19无菌培养皿三2.20无R N a s e玻璃容器:见E.1.2三2.21无R N a s e离心管二无R N a s e移液器吸嘴二无R N a s e药匙二无R N a s e P C R薄壁管:见E.1.3三3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无R N a s e超纯水:见E.2.1三3.1 GⅠ二GⅡ基因型诺如病毒的引物二探针:见A.1三3.2过程控制病毒的引物二探针:见A.1三3.3过程控制病毒:制备见附录C三3.4外加扩增控制R N A:制备见附录D三3.5 T r i s/甘氨酸/牛肉膏(T G B E)缓冲液:见E.2.2三3.65?P E G/N a C l溶液(500g/L聚乙二醇P E G8000,1.5m o l/LN a C l):见E.2.3三3.7磷酸盐缓冲液(P B S):见E.2.4三3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5三3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6三3.1075%乙醇:见E.2.7三3.11 T r i z o l试剂:见E.2.8三4检验程序诺如病毒检验程序见图1三图1诺如病毒检验程序5操作步骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4?以下的环境中进行运输三实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80?冰箱中,试验前解冻三样品处理和P C R反应应在单独的工作区域或房间进行三每个样品可设置2~3个平行处理三5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5c m?2.5c m?2.5c m的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)三5.1.1.2将样品小块移至带有400m L网状过滤袋的样品袋,加入40m LT G B E溶液(软质水果样品,需加入30U A.n i g e r果胶酶,或1140U A.a c u l e a t u s果胶酶),加入10μL过程控制病毒三5.1.1.3室温,60次/m i n,振荡20m i n三酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10m i n检测p H,如p H 低于9.0时,使用1m o l/LN a O H调p H至9.5,每调整一次p H,延长振荡时间10m i n三5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管三10000r/m i n,4?,离心30m i n三取上清至干净试管或三角瓶,用1m o l/L H C l调p H至7.0三5.1.1.5加入0.25倍体积5?P E G/N a C l溶液,使终溶液浓度为100g/LP E G,0.3m o l/L N a C l三60s 摇匀,4?,60次/m i n,振荡60m i n三10000r/m i n,4?,离心30m i n,弃上清三10000r/m i n,4?,离心5m i n紧实沉淀,弃上清三5.1.1.6500μLP B S悬浮沉淀三如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中三加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5m i n三10000r/m i n,4?,离心15m i n,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续R N A提取三5.1.2硬质表面食品5.1.2.1将无菌棉拭子使用P B S湿润后,用力擦拭食品表面(<100c m2)三记录擦拭面积三将10μL 过程控制病毒添加至该棉拭子三5.1.2.2将棉拭子浸入含490μLP B S试管中,紧贴试管一侧挤压出液体三如此重复浸入和挤压3~4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续R N A提取三硬质食品表面过于粗糙,可能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子三5.1.3贝类5.1.3.1戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类三5.1.3.2使用无菌剪刀二手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培养皿中三收集2.0g三5.1.3.3使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管三加入10μL过程控制病毒三加入2.0m L蛋白酶K溶液,混匀三5.1.3.4使用恒温摇床或等效装置,37?,320次/m i n,振荡60m i n 三5.1.3.5将试管放入水浴或等效装置,60?,15m i n三室温,3000r/mi n,5m i n离心,将上清液转移至干净试管,测定并记录上清液m L数,用于后续R N A提取三5.2病毒R N A提取和纯化注:病毒R N A可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒R N A提取纯化试剂盒三提取完成后,为延长R N A保存时间可选择性加入R N a s e抑制剂三操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换三提取出来的R N A立即进行反应,或保存在4?小于8h三如果长期储存建议-80?保存三5.2.1病毒裂解将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积T r i z o l试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5m i n,加入0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/m i n,离心5m i n,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层三5.2.2病毒R N A提取离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5m i n,12000r/m i n,离心5m i n,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三5.2.3病毒R N A纯化5.2.3.1每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤R N A沉淀2次三5.2.3.2于4?,12000r/m i n,离心10m i n,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)三或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀,室温干燥3m i n,不能过于干燥,以免R N A不溶三5.2.3.3加入16μL无R N a s e超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RN A,2000r/m i n,离心5s,冰上保存备用三5.3质量控制5.3.1空白对照以无R N a s e超纯水作为空白对照(A反应孔)三5.3.2阴性对照以不含有诺如病毒的贝类,提取R N A,作为阴性对照(B反应孔)三5.3.3阳性对照以外加扩增控制R N A,作为阳性对照(J反应孔)三5.3.4过程控制病毒5.3.4.1以食品中过程控制病毒R N A的提取效率表示食品中诺如病毒R N A的提取效率,作为病毒提取过程控制三5.3.4.2将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化R N A三可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的R N A量,-80?保存,每次检测时取出使用三5.3.4.3将10μL过程控制病毒的R N A进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用与诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒R N A 的C t值三5.3.4.4以未稀释和梯度稀释过程控制病毒R N A的浓度l g值为X轴,以其C t值为Y轴,建立标准曲线;标准曲线r2应?0.98三未稀释过程控制病毒R N A浓度为1,梯度稀释过程控制R N A浓度分别为10-1二10-2二10-3等三5.3.4.5将含过程控制病毒食品样品R N A(C反应孔),加入过程控制病毒引物二探针,采用诺如病毒实时荧光R T-P C R反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度三5.3.4.6计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒R N A浓度?100%,即(C反应孔)C t值对应浓度?100%三5.3.5外加扩增控制5.3.5.1通过外加扩增控制R N A,计算扩增抑制指数,作为扩增控制三5.3.5.2外加扩增控制R N A分别加入含过程控制病毒食品样品R N A(H反应孔)二10-1稀释的含过程控制病毒食品样品R N A(I反应孔)二无R N a s e超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附录C反应体系和参数,进行实时荧光R T-P C R反应,确定C t值三5.3.5.3计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品R N A+外加扩增控制R N A)C t值-(无R N a s e超纯水+外加扩增控制R N A)C t值,即抑制指数=(H 反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)C t值-(J反应孔)C t值三5.4实时荧光R T-P C R实时荧光R T-P C R反应体系和反应参数详见附录B三反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整三可采用商业化实时荧光R T-P C R试剂盒三也可增加调整反应孔,实现一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测三将18.5μL实时荧光R T-P C R反应体系添加至反应孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒三A反应孔:空白对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针; E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒R N A+1.5μL过程控制病毒引物探针;H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1μL外加扩增控制R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无R N a s e超纯水+1μL 外加扩增控制R N A+1.5μL GⅠ或GⅡ型引物探针;K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针; L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品R N A+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针三6结果与报告6.1检测有效性判定6.1.1需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳性对照(J反应孔)阳性三6.1.2过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率?1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.1.3扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数<2.00;如抑制指数?2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样品R N A 的C t值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也?2.00时,扩增可能无效,需要重新检测;但如抑制指数?2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性三6.2结果判定待测样品的C t值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的C t值小于等于38时,判定为诺如病毒阳性;待测样品的C t值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性三6.3报告根据检测结果,报告检出诺如病毒基因或未检出诺如病毒基因三附录A实时荧光R T-P C R引物和探针GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针见表A.1三表A.1GⅠ二GⅡ型诺如病毒实时荧光R T-P C R引物和探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置诺如病毒GⅠQ N I F4(上游引物):5 -C G CT G G A T GC G N T T CC A T-3 ;N V1L C R(下游引物):5 -C C TT A G A C GC C AT C AT C AT T T A C-3 ;N V G G1p(探针):5 -F AM-T G G A C A G G A G A Y C G C R A T C T-T AM R A-386位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376诺如病毒GⅡQ N I F2(上游引物):5 -A T G T T CA G RT G GA T G A G RT T CT C W G A-3 ;C O G2R(下游引物):5 -T C G A C G C C A T C T T C A T T C A C A-3 ;Q N I F s(探针):5 -F AM-A G C A C G T G G G A G G G C G A T G G-T AM R A-389位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100附录 B实时荧光R T -P C R 的反应体系和参数B .1 实时荧光R T -PC R 反应体系见表B .1三表B .1 实时荧光R T -P C R 反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/μL GⅠGⅡ过程控制病毒R T -P C R 缓冲溶液5?1?555M g S O 425mm o l /L 1mm o l /L 111d N T P s 10mm o l /L 0.2mm o l /L0.50.50.5正义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5反义引物50μm o l /L 1μm o l /L 0.50.50.5逆转录酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5D N A 聚合酶5U /μL 0.1U /μL 0.50.50.5探针5μm o l /L 0.1μm o l /L0.50.50.5R N A 模板――555水(无R N a s e)――111111总体积――252525B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数见表B .2三表B .2 实时荧光R T -P C R 反应参数步骤温度和时间循环数R T 55?,1h1预热95?,5m i n 1扩增变性95?,15s退火延伸60?,1m i n 65?,1m i n 45附录C过程控制病毒培养及引物二探针C.1概要本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病毒三门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒三门哥病毒株M C0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏p o l y[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型三门哥病毒株M C0是一种转基因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒三也可使用商业化试剂或试剂盒中的过程控制病毒三C.2培养试剂和仪器C.2.1H e L a细胞推荐使用E a g l e最低必需培养液(E a g l e sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m,M E M)培养,并将2m m o l/L L-谷氨酸和E a r l e sB S S调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mm o l/L非必需氨基酸,1.0mm o l/L丙酮酸钠, 1?链霉素/青霉素液,100m L/L(生长)或20m L/L(维持)胎牛血清三C.2.2仪器为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的C O2浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养皿)等三C.3培养过程门哥病毒培养在铺满80%~90%单层H e L a(A T C C C C L-2T M)细胞中,置于50m L/LC O2的气氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应三细胞培养器皿经过一个冻融循环,将培养物3000r/m i n离心10m i n三将细胞培养物离心上清留存用于过程控制三C.4引物二探针过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针见表C.1三采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整引物探针三表C.1过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光R T-P C R的引物二探针病毒名称序列扩增产物长度/b p序列位置门哥病毒M e n g o110(上游引物):5 -G C G G G TC C T G C CG A A A G T-3M e n g o209(下游引物):5 -G A A G T A A C A T A T A G A C A G A C GC A C A C-3M e n g o147(探针):5 -F AM-A T CA C AT T AC T GG C CG A AG C-MG-B N F Q-3100位于门哥病毒缺失毒株M C0(详见附录D)的110~209;相当于门哥病毒非缺失毒株M(G e n B a n k登录号122089)的序列110~270附录D外加扩增控制R N A制备1)D.1概要通过将目标D N A序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于R N A聚合酶启动子序列的下游序列,从而表达出外部扩增控制R N A三GⅠ型外部扩增R N A序列位于诺如病毒(G e n B a n k登录号m87661)的5291~5376三GⅡ型外部扩增R N A序列位于L o r d s d a l e病毒(G e n B a n k登录号x86557)的5012~5100三D.2试剂和设备D.2.1限制性酶:用于连接及相关的缓冲液三D.2.2 D N A纯化试剂三D.2.3体外R N A转录试剂(R N A聚合酶,N T P s,缓冲液等)三D.2.4 R N a s e-f r e eD N a s e三D.2.5 R N A纯化试剂三D.2.6 D N A凝胶电泳试剂和设备三D.2.7培养箱:37?三D.3质粒D N A连接添加100n g~500n g纯化的目标D N A和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中R N A聚合酶启动子序列的下游三37?培养120m i n三D N A纯化使用D N A纯化试剂纯化三使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接前与连接后目标D N A和质粒情况三D.4外加扩增控制R N A的表达添加连接后的质粒至转化体系三该体系按照转化体系提供厂家建议配置三使用R N A纯化试剂纯化R N A后,分装,-80?储存,每次检测前取出备用三1)可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制R N A储备液,或者请生物公司代为制备三。
感染性标本收集流程
传染病实验室诊断、传染源调查、自然疫源地监测、流行病学调查研究，都以检出特定的病原微生物或其相关物质为目的。
这类样本来源主要是人和宿主动物、媒介昆虫，也包括水、土壤、食品等样本供调查传染源。
1、病原微生物样本采集的一般注意事项1）针对性：不要求样品代表性，强调针对性，尽可能采集病原微生物含量最多的部位。
2）足量：应采用足够检测用的样本，否则可能会得到假阴性结果。
3）多样性：应采集各种可能作为污染源的食物和环境样本，以及各种可能含有病原体的临床样本。
4）及时性：取样后应尽快测定，以利于疾病控制和患者的治疗。
2、样本保存、包装、运送1）保存：为分离样本中病原细菌或病毒，应根据样本运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH 值的耐受能力，选择合适的培养基和推荐保存温度。
分离培养细菌的样本：在运送培养基中运送并保存于合适的温度，确保目标细菌的存活并抑制其他微生物的过度生长。
除脑脊液、尿液和唾液，其他样本若不能在 24小时内处理，多数可存放在室温；若长期保存，除一些低温敏感细节处，应存放在4℃~8℃条件下。
分离病毒的样本：一般应放在保温容器（0℃~4℃）里，不可放置超过 2 天，尽早送到实验室进行病毒分离。
如无条件立即运送或不能立即分离病毒时，应将样本冻存保存。
若长期储存，最好置-70℃冻存。
检测抗原或抗体的样本：检测抗体的血清可在 4℃条件下保存约 1 周，最长 10 天，超过 1 周必须在-20℃条件下冷冻。
注意避免不必要的反复冻融。
运送过程中若无设备保证血清的冷冻状态，最好不要冷冻血清。
在室温存放血清虽不理想，但仍可用于检测抗体，甚至是存放数周的血清。
不要仅因为没有冷冻设备而将已采集的血清轻易弃去。
保证样品运送温度的方法：为维持4℃~8℃，运送盒中围绕第 2 层容器至少要填充 4个冰袋，可维持冷藏 2~3 天。
为保证-20℃条件，在外包装袋内用 2kg 干冰，但需确保二氧化碳能释放以防爆炸，这样可维持样本冷冻 1~2 天，为保证-70℃条件，可采用液氮来储存和运送。
诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
由于粪便成分复杂，影响因素多，可能出现假阳 性，应结合临床症状和流行病学特征分析结果。
检测结果分析
根据既往社区诺如病毒感染监测数据和近年诺如 病毒感染暴发标本检测情况等，对暴发疫情标本 检测结果提出以下分析供参考，同时需综合考虑 疫情现场流行病学调查结果等情况。
一、病例
发病3天内的粪便（最好） 带便肛拭子或呕吐物标本
一式两份（致病菌、病毒） 病例数20例以下，全部采集
20例及以上，至少采集20例病例标本 发病超过3天的和已痊愈病例可不采样 保存条件及登记样本相关信息：姓名、性别、
年龄，发病时间、采集时间等 附件8和附表8-1
二、厨工
抑制物过多，影响核酸检测结果。
标本处理（10%便悬液制备）
0.1ml/0.1g 粪便标本（固体豌豆粒大小）
900μl PBS
漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次15s 室温静止10min
4 ℃ ≥ 5000 rpm离心5min或≥ 3000 rpm离心30min
10%便悬液上清
标本处理
肛拭子和环境涂抹标本 经漩涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测 或置-20℃冰箱保存备用。
唾液 用灭菌平皿或广口容器留取1ml，或用棉拭子 沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。
食品 将残余食物用灭菌镊子或匙采取，置于灭菌容器； 如无残余食物，可用干净拭子在盛放过可疑食物 的容器内涂擦，然后置于装有2ml生理盐水或病毒 保存液试管内。 由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集 量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低 检出限和可能的用量协商确定。
病毒感染性腹泻患者肛拭样品中诺如病毒分析研究
病毒感染性腹泻患者肛拭样品中诺如病毒分析研究郑磊;余玮;顾丽萍【摘要】目的了解本地区病毒感染性腹泻患者诺如病毒感染情况,进一步探索诺如病毒流行规律和流行因素,为制订防控对策提供依据.方法从2008年3月至2010年2月由嘉定区中心医院采集病毒感染性腹泻患者肛拭样品共572份,采用实时荧光逆转录聚合酶链反应法(Real-Time RT-PCR)检测病毒核酸.结果 572份病毒感染性腹泻患者肛拭样品中RT-PCR检测核酸阳性53例,阳性率为9.27%.结论嘉定区病毒性感染腹泻中有近10%的患者由诺如病毒感染引起,冬季可能为流行高峰,65岁以上为重点人群.%The purpose of this study was to investigate prevalence of norovirus infection in patients with viral infectious diarrhea, analyze factors associated with norovirus epidemic , and facilitate control and prevention of norovirus infection in Jiad -ing, Shanghai. A total of 572 anal swabs from patients with viral infectious diarrhea were collected at the Center Hospital in Jiading, March 2008 to February 2010 , and detected for norovirus RNA by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) . Fifty-three (9 .27% ) specimens were positive for norovirus RNA . It was indicated by intensive analysis that norovirus infection occurred in the winter , and that population group of the elderly (aged 65+ years) was more susceptible.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(029)006【总页数】3页(P636-638)【关键词】诺如病毒;病毒感染性腹泻;逆转录聚合酶链反应法【作者】郑磊;余玮;顾丽萍【作者单位】上海市嘉定区疾病预防控制中心,上海,201800;上海市嘉定区疾病预防控制中心,上海,201800;上海市嘉定区疾病预防控制中心,上海,201800【正文语种】中文【中图分类】R373.2自1968年诺如病毒在美国诺瓦克市发现后，越来越多的研究证实诺如病毒是急性胃肠炎爆发疫情最主要的病原，也是成人、儿童非菌性腹泻主要的病原体［1－2］。
2015年新疆巴州地区腹泻患者中诺如病毒RT-PCR检验初探
2015年新疆巴州地区腹泻患者中诺如病毒RT-PCR检验初探摘要：目的：探讨腹泻患者中诺如病毒RT-PCR检验结果及曲线分析。
方法：对巴州地区哨点医院巴州第一人民医院上送的腹泻病粪便标本中的诺如病毒，进行RT-PCR检验。
结果：从2015年上送的241份腹泻患者粪便中，检测出33份诺如病毒GⅡ型阳性标本，检出率达13.69%；检测出2份诺如病毒GⅠ型阳性标本，检出率为0.83%。
结论：新疆巴州地区腹泻患者中诺如病毒多为GⅡ型，阳性标本RT-PCR曲线应与阳性对照保持相似的“S”型曲线，在FAM通道和HEX通道峰值要大于2000。
关键词：腹泻；诺如病毒RT-PCR检验诺如病毒检测是我们实验室根据今年新疆卫生厅、巴州卫生局相关文件精神在2015年新开展的一个项目，当前诺如病毒感染在感染性腹泻中所占比例逐年增高[1]，及时在本地区开展诺如病毒的检验工作是十分重要和必要的，我们实验室结合前期具备较好的艾滋病、麻疹、流感、手足口病等RT-PCR检验人员及仪器、技术储备，严格按照诺如病毒检测方法，经过内部人员比对，方法比对，平行双样等质控方法，探讨了腹泻患者中诺如病毒RT-PCR检验结果及曲线分析，具体如下。
1资料与方法1.1一般资料 2015年5月-10月，我们实验室对巴州地区哨点医院巴州第一人民医院上送的241份腹泻病粪便标本进行了诺如病毒RT-PCR检验。
哨点医院上送标本为水样便或粘液便，密封装在便盒中，每份大于5g（ml），当天上午采集后，下午上送至我们实验室，并立即进行检测。
1.2方法1.2.1检验材料病毒RNA/DNA提取试剂盒（苏州天隆生物科技有限公司），诺如病毒核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）。
1.2.2检验仪器美国bio-rad伯乐170-9780 iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System。
1.2.3检验方法根据《新疆细菌性肠道传染病监测方案》标本采集和检测方法的要求，取黄豆颗粒大小粪便或100μl水样腹泻物置于1.5ml离心管中，加入400μl裂解、氯仿混合液，13000rpm离心15min备用。
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水 用干净无菌瓶采集疑似被污染的饮用水或生活 用水。 由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采 集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的 最低检出限和可能的用量协商确定。
环境涂抹标本 可用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或PBS液 容器内。
三、标本运送与贮存
标本采集后冷藏于10℃以下立即送检，同时附 样品送检表（附表8-1）。 标本在采集交送过程中尽量固定、防止泄漏， 如需长途运输，应放在有密封圈的螺口管中； 注意防止交叉污染。 如不能尽快开展检测，应贮存在-20℃冰箱短 期保存。
当用某一种方法检测诺如病毒为阴性，而流行 病学无法排除诺如病毒感染时，建议选用另一 种方法检测诺如病毒。
一、病例
发病3天内的粪便（最好） 带便肛拭子或呕吐物标本 一式两份（致病菌、病毒） 病例数20例以下，全部采集 20例及以上，至少采集20例病例标本 发病超过3天的和已痊愈病例可不采样 保存条件及登记样本相关信息：姓名、性别、 年龄，发病时间、采集时间等 附件8和附表8-1
标本检测——核酸检测
核酸提取（多种商业试剂，如Qiagen、罗氏等） 病毒RNA提取试剂（推荐） 病毒总核酸提取试剂 进行PCR实验时，容易受到来自人、细菌等非 目标物种基因的影响，产生假阳性。 核酸提取完成后，尽快放入冰箱，如果3天内检 测，10℃以下保存即可，否则放入-70℃冰箱保存。 注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、 灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。
唾液 用灭菌平皿或广口容器留取1ml，或用棉拭子 沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。
食品 将残余食物用灭菌镊子或匙采取，臵于灭菌容器； 如无残余食物，可用干净拭子在盛放过可疑食物 的容器内涂擦，然后臵于装有2ml生理盐水或病毒 保存液试管内。 由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集 量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低 检出限和可能的用量协商确定。
漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次15s
室温静止10min
4 ℃ ≥ 5000 rpm离心5min或≥ 3000 rpm离心30min
10%便悬液上清
标本处理
肛拭子和环境涂抹标本 经漩涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测 或臵-20℃冰箱保存备用。 呕min，或≥3000r/min离心30min，吸上清， 立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
原则
诺如病毒检测方法及结果分析
标本处理
粪便 流程如下图。 制成10%的便悬液后，立即检测或臵-20℃冰箱 保存备用。 注意:便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中 抑制物过多，影响核酸检测结果。
标本处理（10%便悬液制备）
0.1ml/0.1g 粪便标本（固体豌豆粒大小）
900μl PBS
核酸检测
荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR) 诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感 性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RTPCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。 目前国内商业化的试剂可检测GI和GII组病毒 ，但对于GⅣ组病毒的检测效果还不清楚，有 些试剂的GI组检测效果也相对较差，因此如果 检测结果为阴性，不能完全排除该病毒感染。
检测结果分析
根据既往社区诺如病毒感染监测数据和近年诺如 病毒感染暴发标本检测情况等，对暴发疫情标本 检测结果提出以下分析供参考，同时需综合考虑 疫情现场流行病学调查结果等情况。
粪便标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出阳 性率高于20%，可能为诺如病毒暴发；在流行季节 ，诺如病毒检出阳性率高于40%，可能为诺如病毒 暴发。 肛拭子标本：如果在非流行季节，诺如病毒检出 阳性率高于20%，可能为诺如病毒暴发；在流行季 节，诺如病毒检出阳性率高于25%，可能为诺如病 毒暴发。 各类标本如低于上述比例，需考虑是否存在其他 主要病原体。
核酸检测
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 国际上常用检测方法，准确、灵敏 虽敏感性和特异性较real-time RT-PCR方法低， 但可以进行病毒基因型的分型测序研究，对于流 行病学具有重要意义。 注意事项： 1.粪便中抑制PCR反应的成分多，可能造成假阴 性，可通过稀释标本降低抑制物浓度来解决 。
三、食品和水
由于目前国家没有食品和水中诺如病毒 检测的标准方法，食品和水等样本的采 集和检测工作根据实际情况确定。
流行病学依据
四、环境样品
可根据疫情调查需要采集各类场所 （如厨房、厕所等）的环境涂抹标本。
原则
样品采集、运输和保藏 （附件8）
一、采样对象与数量
标本种类 粪便（最好） 带便肛拭子和呕吐物 特殊情况时采集唾液用于人体易感性检测 可根据疫情调查需要采集食品、水及各类场所 （如厨房、厕所等）的环境涂抹样品 采样数：病例数20例以下，全部采集 20例及以上，至少采集20例病例标本
诺如病毒感染性腹泻
样品采集与检测
广东省疾病预防控制中心 （2015年11月25日）
主 要 内 容
■不同类型标本的采集要求 ■样品采集、运输和保藏
■诺如病毒检测方法及结果分析
原则
不同类型标本的采样原则
一、病例
根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点 病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病 厨工、重点岗位的病例等的标本； 疫情进展过程中，应选取各阶段一定比例的 现症病例采集标本。
二、采集要求
粪便、带便肛拭子和呕吐物 粪便可用便盒采集 肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBS液 后，插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm）处，轻轻旋转擦取 直肠表面带便粘液，臵于含病毒保存液的采样管中。 呕吐物可注入灭菌容器内 采集的最优时间在发病后48-72小时内 采集量3g/3ml左右 采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部 被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。 样本采集后，立即冷藏保存。
二、厨工
食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好） 或带便肛拭子标本 涉疫单位的厨工人数在30人以下，全部采样； 30人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作， 从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期 出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集30人。
2.由于诺如病毒基因变异大，目前还没有一对引 物能把所有基因型都检测出来，这也可能造成 假阴性结果。 3.采用套式PCR方法可进一步提高检测的灵敏度和 特异性，但非常容易造成实验室污染，因此操 作时需做好防污染措施。
抗原检测——酶链免疫法（ELISA）
操作简便、结果较稳定。在标本数量多、种类主 要为粪便的暴发疫情检测中可考虑使用此方法。 由于病毒抗原制备复杂，病毒变异大，只能检出 与抗体同源或相近的病毒，因此对于某些型的病 毒可能无法检测到。现有质量较好的试剂盒对于 目前引起暴发的主要基因型一般可以检出。 由于粪便成分复杂，影响因素多，可能出现假阳 性，应结合临床症状和流行病学特征分析结果。