16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用

16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用

摘要

随着生物技术的迅速发展，16SrDNA分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到广泛应用。根据16SrDNA的保守域和高变域，可以进行种属的鉴定。16SrDNA分析技术克服了传统生物培养法的限制，操作方便，检测快，准确度高且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估，是一种客观且可信度高的分类方法。

关键词

16SrDNA 微生物分类鉴定

传统的微生物分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。但近几十年来，传统微生物分类鉴定得到了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定。

1.微生物形态比较分类法的局限性

1.1 不能正确反映微生物形态

由于微生物菌群在进行纯培养时，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，人为地改变了原始菌群的微生物生态构成，对研究结果造成了较大的偏差①。这样在应用上就只能局限于对简单环境下的微生物的研究，而对复杂环境下的微生物不能加以有效分析，严重影响了微生物基因组的研究。

1.2微生物资源大量丢失

许多研究研究表明，在自然环境中有相当多的菌种（约90%～99%）用纯培养方法无法培养出来。同时，纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，仅占环境微生物总数的0.1%～1%②。因此，由于绝大多数微生物无法培养得到，丢失了大量微生物资源，对微生物多样性的认识较片面。

1.3不能保证分类的准确性和科学性

对形态特征、理化特征、菌体某些化学成分等特征完全相同时，可较准确的分类，但是对某特性中有某些差异的，往往难以判断。而且，方法繁琐耗时。

2. 16SrDNA及其鉴定依据

2.1 16SrDNA简介

16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,长度约1500bp,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”, 其序列包含10 个可变区( variable region ) 和与之相间的11 个恒定区( constantregion) ,可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。。Woese等③与Olsen等④基于16SrDNA的分析构建了现已被公认的全生命系统进化树。越来越多的细菌依据16SrDNA 被正确分类或重分类,尤其是许多环境中的细菌⑤、⑥ ,如Funke等将棒杆菌依赖细胞毒性1组及类似棒杆菌重新确定为放线菌的一个新种,即钮氏放线菌种, Bennasar等通过比较14株施氏假单胞菌的7个基因型(DNA2DNA杂交同源

组) ,发现SP1402T( T为模式株)和SL401与施氏假单胞菌模式株明显不同,从而命名为一个新种称巴利阿里假单胞菌( Pseudomonasbalearica) ②。

2.2鉴定依据

原核生物的rRNA含有3种类型:23S、16S和5SrRNA，它们分别含有的2,900,1,540和120个核苷酸。5SrRNA虽易分析，但核昔酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究，而23SrRNA含有的核苷酸几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。经过大量的研究证明16SrDNA的全长约为1,540bp，片段长度适中，信息量较大且易于分析⑦。在相当长的进化过程中，rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了古老祖先的一些序列，所以从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系。rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索:高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。

16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，而16SrDNA是编码该亚基的基因。在细菌的16SrDNA中有多个区段高度保守，根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物，可以用来扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子⑧。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

2.3 16SrRNA/rDNA序列分析

在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时，由于分离培养技术的限制，难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析，这样16SrRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。16SrDNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中提取16Sr1ZNA的基因片段。通过克降、测序或酶切、探针杂交获得16SrRNA序列信息，再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类⑨。 DNA分析技术是在一系列分子技术的基础上发展起来的，其中RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP (Restriction Fragment Lengm Polymorphism)、AFLP(Amplified Restfiction Fragment Polymorphism)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳((TGGE )等技术是分子生物学技术的核心。⑩

3.结语

传统培养分离方法积累了种群分类的大量数据，为现代分子生物学技术提供了良好的背景材料，在功能特性的认识具有独特的优势。而以16SrDNA为基础的现代分子生物学技术提高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，可以实现快速，微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。相信随着分子生物学技术和研究方法的创新的完善，对微生态系统的认识必将不断地深入，并能够合理有效地加以开发和利用，使科学技术切实得以服务十生产实践。

参考文献：