琼脂糖凝胶电泳操作步骤

实验原理、材料、方法、结果、讨论

琼脂糖凝胶电泳操作步骤

琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB

凝胶板的制备：加梳子，倒胶

样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝

加样：加样端为负极（黑）

电泳：5V/cm

观察：紫外灯下观察，照相

PCR-SSCP

聚合酶链反应单链构象多态性

PCR实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA 聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。

介绍：PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

PCR-SSCP分析的基本程序：

1、通过PCR扩增特定靶序列，

2、将扩增产物变性为单链，

3、进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

PCR反应体系：（单位：微升）

Buffer液： 2.5

引物1： 1

引物2： 1

dNTP: 2

模板DNA： 1

双蒸水： 16.5

Taq DNA聚合酶： 1

非变性聚丙烯酰胺凝胶:

1、30%聚丙烯酰胺（交联度49:1） 4ml，

2、50×TAE缓冲液 0.2ml，

3、1%TEMED 1ml

5、蒸馏水 4.7ml，

4、10%过硫酸铵（AP） 0.1ml

银染步骤：

1、电泳结束，小心取出凝胶，置10%乙醇液中固定5分

钟。（防止再扩散）

2、置凝胶于1%硝酸氧化3分钟。（预处理）

3、用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。

4、置凝胶于0.012mol/L硝酸银液中20分钟。使银离子

与DNA结合。

5、弃去硝酸银，用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。

6、用0.019%甲醛液，含0.28mol/L无水碳酸钠使胶还

原，银离子变成银颗粒而显色。直至所需的显色深度。

7、置凝胶于10%冰乙酸停止还原反应。

8、弃去冰乙酸，以双蒸水洗涤即可

混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TAE），缓冲液应高于加样孔上缘。

结果分析:

单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA 单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。