比色法和分光光法
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价电子能级的能量＋振动能级的能量＋转动能级的能量 能级差与对应的光谱
价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。
吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发
吸收池（比色池、比色皿）： ➢用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 ➢因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 ➢杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差。 检测系统：
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000um 10um
波 长
100nm 10nm
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm 橙 590 － 620nm 黄 570 － 590nm 绿 550 － 570nm 青 495 － 550nm 蓝 450 － 495nm 紫 380 － 450nm
工作曲线（标准曲线）：
测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一 曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比。 ➢理想情况下工作曲线过原点； ➢直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要 求两个数量级以上的线性范围； ➢样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。
偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。
20.3 比色法和分光光度法及其仪器
1. 光度分析方法 ➢ 目视比色法： ➢ 光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的
吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光； ➢ 分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准 溶液的吸光度。
分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。
190－400nm
2. 可见光吸收光谱
➢单色光：单一波长光 黄
➢复合光：复合波长光
绿 青
➢互补光：处于同一直
线上的两种光。
橙
白光
青蓝
➢互补光按一定强度比 例混合，即得白光。
➢溶液颜色：互补光的 颜色。
红
wk.baidu.com
蓝
紫
光的互补色示意图
3. 吸收光谱曲线
透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。
第二十章 比色法和分光光度法
20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法
20.1 概述
20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： ➢ 灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 ➢ 准确度高。相对误差2－5％。 ➢ 仪器设备简单、操作简便。 ➢ 应用范围广。
偏离比耳定律的原因：
比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无 相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略。
入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件（单色器） 很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带， 而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。
化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、 悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增 大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。
➢单色器：由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜 和出射狭缝构成。
➢玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长 范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ） 则可用于整个紫外-可见光区。
➢光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围 宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而 产生相互干扰。
吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，被吸收的光的比例。
吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射 光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。
最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱 曲线上的最大峰值。
Absorbance(AU)
0.6 1 0.5
0.4
3
2. 分光光度计的基本部件
检
结
光 源
单 色 器
吸 收 池
测 系 统
果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
即： A lg I0 lg 1 kb
I
T
A为吸光度; I0为入射光强
I为透过光强; T为透光度
I0
I
k’为比例常数
b为液层厚度（光程长度） b
➢ 比耳（Beer）定律：
一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与 吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：
A lg I0 kc I
0.3 4
0.2
0.1
2
0
-0.1
190
240
290
340
390
wavelength(nm)
四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图
1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯
4. 物质吸收光的本质
物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动；
分子自身的转动。 分子的能量
态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以
光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。
紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，
从基态跃迁到激发态。
20.2 光吸收定律
➢ 朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的
溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。
➢ 朗伯-比耳定律：A kbc
当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸
光系数，其单位为cm-1mol-1L。
A bc
的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。
A bc
思考：摩尔吸光系数如何测定？
朗伯-比耳定律的适用范围： ➢不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光 物质和固态吸光物质； ➢它是各种吸光光度法定量分析的依据。
价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。
吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发
吸收池（比色池、比色皿）： ➢用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 ➢因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 ➢杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差。 检测系统：
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000um 10um
波 长
100nm 10nm
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm 橙 590 － 620nm 黄 570 － 590nm 绿 550 － 570nm 青 495 － 550nm 蓝 450 － 495nm 紫 380 － 450nm
工作曲线（标准曲线）：
测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一 曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比。 ➢理想情况下工作曲线过原点； ➢直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要 求两个数量级以上的线性范围； ➢样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。
偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。
20.3 比色法和分光光度法及其仪器
1. 光度分析方法 ➢ 目视比色法： ➢ 光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的
吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光； ➢ 分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准 溶液的吸光度。
分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。
190－400nm
2. 可见光吸收光谱
➢单色光：单一波长光 黄
➢复合光：复合波长光
绿 青
➢互补光：处于同一直
线上的两种光。
橙
白光
青蓝
➢互补光按一定强度比 例混合，即得白光。
➢溶液颜色：互补光的 颜色。
红
wk.baidu.com
蓝
紫
光的互补色示意图
3. 吸收光谱曲线
透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。
第二十章 比色法和分光光度法
20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法
20.1 概述
20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： ➢ 灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 ➢ 准确度高。相对误差2－5％。 ➢ 仪器设备简单、操作简便。 ➢ 应用范围广。
偏离比耳定律的原因：
比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无 相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略。
入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件（单色器） 很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带， 而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。
化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、 悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增 大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。
➢单色器：由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜 和出射狭缝构成。
➢玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长 范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ） 则可用于整个紫外-可见光区。
➢光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围 宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而 产生相互干扰。
吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，被吸收的光的比例。
吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射 光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。
最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱 曲线上的最大峰值。
Absorbance(AU)
0.6 1 0.5
0.4
3
2. 分光光度计的基本部件
检
结
光 源
单 色 器
吸 收 池
测 系 统
果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
即： A lg I0 lg 1 kb
I
T
A为吸光度; I0为入射光强
I为透过光强; T为透光度
I0
I
k’为比例常数
b为液层厚度（光程长度） b
➢ 比耳（Beer）定律：
一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与 吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：
A lg I0 kc I
0.3 4
0.2
0.1
2
0
-0.1
190
240
290
340
390
wavelength(nm)
四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图
1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯
4. 物质吸收光的本质
物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动；
分子自身的转动。 分子的能量
态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以
光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。
紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，
从基态跃迁到激发态。
20.2 光吸收定律
➢ 朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的
溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。
➢ 朗伯-比耳定律：A kbc
当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸
光系数，其单位为cm-1mol-1L。
A bc
的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。
A bc
思考：摩尔吸光系数如何测定？
朗伯-比耳定律的适用范围： ➢不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光 物质和固态吸光物质； ➢它是各种吸光光度法定量分析的依据。