比色法和分光光法
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
比色法和分光光度法的基本知识
比色法和分光光度法的基本学问**节比色法和分光光度法的基本学问一、光的特性光是由光量子构成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。
波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：λ＝C/V式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。
Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。
Ｃ为光速等于299770千米／秒。
光属于电磁波。
自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1—1所示的波谱图。
分光光度法所使用的光谱范围在200nm—10μ（1μ=1,000nm）之间。
其中200nm－400nm为紫外光区，400nm －760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。
二、光的互补色假如两种色光（单色光或复色光）以适当地比例混合而能产生白色感觉时，则这两种颜色就称为“互为补色”。
非发光物体的颜色（如颜料），重要取决于它对外来光线的汲取和反射，所以该物的颜色与照射光有关。
一般把物体在白昼光照射下所呈现的颜色称为该物体的颜色。
假如将白昼光照射在黄蓝两种颜色混合后的表面时．因黄颜料能反射白光中的红、橙、黄和绿四种色光，而蓝色光能汲取其中的红、橙和黄三种色光，结果使混合颜料显示绿色。
这种颜色的混合与色光的加色混合不同，三、光的选择性汲取物质对光的汲取是物质和光能相互作用的一种形式。
由于光的波粒二象性只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被汲取，而物质的基态和激发态是由物质的原子结成和原子间相互作用决议的，不同的物质的能态不同，对光的选择性汲取也就不一样。
所以物质对光具有选择汲取性。
要讨论光的选择性汲取，首先必需搞清楚其产生的机理。
原子是由质子和核外电子构成的，核外电子以不同速度在质子四周不同轨道上旋转，每个轨道的能级是不一样的。
好像卫星围绕地球转的情况是相像的。
同时，每个轨道又有方向不同的亚轨道，而同一轨道的不同亚轨上的能量也是不相同的。
当电子的运动轨道更改都会伴有汲取和释放能量。
所以不同的能量变化有不同的汲取光谱。
比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
2
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目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
2.2目视比色与分光光度计
光屏
M1
发生衍射和干涉现象而 分光.
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
检测器
h Au，Ag Ag、Au
半导体
Se
硒光电池
光电管
碱金属 光敏阴极
h Ni环（片）
红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
光电倍增管 160-700 nm
待扫描
1个光电子可产生106～107个电子
23
用于药物的鉴别、杂质检查 （紫外分光光度法）
• 1．吸收曲线：每一种物质对不同波长光 的吸收程度是不同的 。如果我们让各种 不同波长的光分别通过被测物质，分别 测定物质对不同波长光的吸收程度。以 波长为横坐标，吸收程度为纵坐标作图 所得曲线。
24
例：丙酮 max = 279nm ( =15)
3.2 理化法-比色分析法 一、 光度分析的几种方法
1.目视比色法
观察方向
比 色 管
cc2 1
c1
c2
c3
c3
c4
c4
用眼睛观察比较标准液和待测液的颜色测其含量。 方法方便、简单，准确度差（相对误差约为5%～ 20%）。常用于限界分析，如药物的杂质检查。 1
2. 吸光光度法和分光光度计
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光，波 长可调。根据波长范围不同，可分为可见分光光 度计和紫外分光光度计。 特点： ①灵敏度高，可达10-4g•ml-1—10-7g•ml-1； ②准确度高，相对误差为2％—5％；
Fe%=[(5×10-6×50×100/5)/0.3866]×100％ ＝0.026％
19
紫外分光光度法在药物含量测定中的应用
测定方法 测定时，应以配制供试品溶 液的同批溶剂为空白对照（通常吸收池 和溶剂本身有吸收，应扣除）。一般供 试品溶液的吸收度读数，以在0.3—0.7之 间的误差较小。 E1%1cm：指在一定波长下，溶液浓度 (C)为1％(W/V)，l＝1cm时的吸收度。
第二十章 比色法和分光光度法
3、朗伯-比尔定律
4、透光度（透射比） 5、吸光系数（吸收系数） 6、摩尔吸收系数
书P398： 例题20-1
二、吸光度的加和性 测得溶液的吸光度等于各组分的吸光度之 和。 A总 = ∑ Ai ＝κ1 b c1 + κ2 b c2 + …… κn b cn
三、朗伯-比尔定律的偏离 1、比尔定律的局限性 2、非单色入射光引起的偏离
4、颜色的产生：物质对不同波长的光具有选
择性吸收作用而产生了不同颜色。
5、光吸收曲线 6、吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
7、物质定性分析的依据：不同物质的溶液，
其最大吸收波长不同。
20.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定 1、朗伯定律 朗伯(Lambert) 1760年阐明了光的吸收程 度和吸收层厚度的关系。 A∝b 2、比尔定律 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度 和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A∝ c
一、光度分析法的特点 1、灵敏度高 2、准确度能满足微量组分测定的要求 3、操作简便快速，仪器设备简单
二、物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光称为单色光。 2、复合光：由不同波长的光组成的光称为复
合光。如可见光。 3、互补色光：两种适当颜色的单色光按一定 强度比例混合可成为一种白光，这种两种单 色光称为互补色光。
A
λ1 A
λ2
λ
λ1
λ2
λ
Aλ1= kaλ1bCa ＋kbλ1bCb Aλ2= kaλ2bCa ＋kbλ2bCb
三、光度滴定 四、酸碱解离常数的测定 五、配合物组成的测定 1、饱和法 2、连续变化法
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
分析比较目视比色法和分光光度法
分析比较目视比色法和分光光度法目视比色法和分光光度法都是常见的实验室酸碱测定方法之一，它们具有易操作、灵敏度高、设备简单等特点，因此普遍应用于药物和食品分析领域。
两种方法各有特点及使用区别，本文将分析比较这两种方法的不同点，为两种方法的运用提供参考。
首先，来自于二者的原理：目视比色法基于酸碱指示剂的色谱变化来合成检测酸碱度。
大多数指示剂在某一范围酸碱度值内变化色谱来表示酸碱度，由此可更直观地检测溶液的酸碱程度。
而分光光度法是认为根据不同浓度环境下有机物的光谱吸收特性，针对影响酸碱度溶液的组分，把其选定最佳紫外光谱吸收波数，结合特定的酸碱指示剂检测溶液的PH 值。
因此可以认为，目视比色法的原理是根据酸碱指出剂色谱的变化，而分光光度法是借助特定指示剂测量溶液的吸光度以及紫外吸收特性。
其次，从实际操作上来看，有些明显的区别。
使用目视比色法时，首先需要准备一些酸碱指示剂悬浮液，然后在标准玻璃比色杯内量取被检测溶液，并加入适量的指示剂，当被检测溶液与指示剂混合时，即可出现典型的比色条带，通过比较比色条带的色彩深浅，即可间接的推测出溶液的酸碱度范围。
而使用分光光度法时，首先需将酸碱指示剂浓度稳定后，再添加相应溶液，通过溶液中有机物紫外吸收比对着色体紫外吸收光谱特征，然后通过取舍紫外吸收光谱仪湿润以及滨值，来计算溶液的酸碱度。
最后，在结果稳定性方面，基于以上介绍可得知，目视比色法更加依赖于操作者的经验以及眼力，若不加以严格控制，操作者看到的酸碱度或会有较大的偏差，因此对结果的稳定性比较差。
而分光光度法更加严谨，结果准确稳定，而且分析速度很快，更适用于批量测定。
综上所述，目视比色法和分光光度法的原理基础不同，在操作上也有较大的差异，两者属于不同的测定技术，各有优势，在不同的场合会选择不同的分析方法使用，根据检测条件确定对应的检测方法，确保最终结果的精准可靠性。
第十五章比色法和分光光度法
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下 吸光度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最大。 此特性可作为物质定量分析的依据。
15.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定律
1、朗伯—比尔定律
一束平行单色光照射透明溶液时，光的一部分被吸收， 一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。
Ir
Ia
It
价电 子
分子 振动
分子 振动
分子 转动
肉眼可见
单色光：只具有一种波长的光。 复合光：由两种以上波长组成的光，如白光。
白光（如日光）是复合光，是由红、橙、黄、绿、 青、蓝、紫等光按适当的强度比例混合而成的，在 400nm～750nm 范围的一种复合光。
2、物质对光的选择性吸收
当光通过透明的物质时，具有某种能量的光子被 吸收，而另外能量的光子不被吸收。光子是否被物 质吸收，既决定于光子的能量，又决定于物质的内 部结构。
（组成固定） Fe3+ + SCN - → FeSCN2+、 Fe(SCN)2 + ……
（组成不固定）
4、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。如三 磺基水杨酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它 无干扰。
5、显色过程易于控制，而且有色化合物与显 色剂之间的颜色差别应尽可能大。
| m M a R xm R ax|60nm
κ与温度、波长及吸收物质本身的性质有关，与 吸收物质浓度无关。
分光光度的灵敏度
κ越大表明该物质的吸光能力越强，用光度 法测定该物质的灵敏度越高。 κ>105：超高灵敏； κ=(6～10）×104 ：高灵敏； κ< 2×104 ：不灵敏。
桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数)用S来表示。
比色分析和紫外可见分光光度法的区别
近紫外 200~400nm 中红外 2500~50000nm 无线电 1~1000nm
本章内容涉及到的光谱区域为近紫外和 可见光。
光的粒子性是指光是一粒一粒不连续的，具有பைடு நூலகம்
一定能量的粒子即光子构成的。光子的能量（E）与
光的频率ν成正比，而与波长成反比，即：
E=hν=h（C/λ）
式中：h —— 普朗克（Planck）常数，数值为 6.6262×10-34J•S
1.145
K K1 K2 K3 K4 1.255 1.180 1.180 1.145 1.190
第二章 比色分析和紫外可见分光光度法
第一节 比色分析和分光光度法的定义及特点 第二节 物质对光的选择性吸收 第三节 朗伯-比耳定律 第四节 分析仪器 第五节 紫外吸收光谱 第六节 影响分光光度法分析的因素 第七节 紫外可见分光光度法的应用 第八节 对分光光度法分析方法的评价
第一节 比色分析和分光光度法的定义及特点
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光
的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体）
时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部 为I分a，光透透过过光溶强液度，为如It果，入反射射光光强强度度为为IIr0，，那吸么收，光强度
被测溶液的浓度越大，颜色越深。
4、比色方法
（1）目视比色法； （2）光电比色法。
5、显色反应
（1）定义： 进行比色分析时，通常需要加入适当的试
剂，使待测物质与试剂反应生成便于比色测定
的有色物质，此反应称为显色反应，所加入的 试剂称显色剂。
第二章 比色分析与分光光度分析
2.选择适当的显色反应条件
3.分离干扰离子
四、测量条件的选择
吸光度的测量：将被测溶液盛放在吸收池中，放入分光光度 计光路中。 如图所示：
入射光 I0
透射光 It
A=lg(I0/It)
MR吸收 试样中其他成分吸收
溶剂和试剂吸收
吸收池对光的反射和吸收
A （样品） = A （MR） + A （干扰）+ A （吸收池） 为了使吸光度真正反映待测组分的浓度，需扣除非待测 组分的影响——使用参比溶液 参比溶液：将不含待测离子的溶液或试剂加入一比色皿 中，试液放入另一比色皿中，再调节仪器，使不含待测离子 溶液处于T=100%（A=0）处，此种溶液为参比溶液。 目的是为了消除由于比色皿、溶剂及试剂对入射光的 反射和吸收等带来的误差。 A （参比） = A （干扰）+ A （池）=0
互补色光和各种颜色光的波长范围，可作为光度测定时选择 测量波长的参考
4.吸收曲线
若以不同波长的光照 射某一溶液，并测量每 一波长下溶液对光的吸 收程度（即吸光度A）， 以吸光度为纵坐标，相 应波长为横坐标，所得 A-λ曲线，称为吸收曲线。 它更清楚地描述了物质 对光的吸收情况。
任何一种溶液对不同波长光的吸收程度是不一样的。
绿 蓝绿
黄绿 黄
绿蓝
橙
蓝
红
紫
紫红
图中处于对角线上的两种单色光为互补色光。
例如蓝色光和黄色光、绿色光和紫红色光互补等
3. 光的选择性吸收和溶液的颜色
一种物质呈现何种颜色，与入射光组成和物质本身的结构
有关,而溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的吸光质点(离子或 分子)选择性地吸收某种颜色的光而引起的。 常见的有下列三种情况：
第四节 比色法及分光光度计
3、工作原理：白光经过聚光并通过棱镜或光栅后，得到一束 平行且波长范围很窄的单色光，此单色光通过比色皿内一 定厚度的溶液后照射在光电管上，则有光电流产生，该光 电流的大小与照射到光电管上的光强度成正比，于是检流 计的读数尺上就能读出相应的百分透光率或吸光度。
4.2 分光光度法
4.2 分光光度法
6、应用举例 例1：P162例8-2 例2：P162例8-3
例：取1.000g钢样溶解于HNO3，其中的 Mn用KIO3氧化成KMnO4并稀释至100mL， 用1.0cm吸收池在波长545nm测得此溶液的吸 光度为0.720。用1.64×10-4 mol/L KMnO4作 为标准，在同样条件下测得的吸光度为0.360， 计算钢样中Mn（55）的百分含量。
1
2
3 4
5
待测溶液
系列标准溶液
4.1 目视比色法
例1 ：课本P158，磷的比色测定。 例2：NH4Cl中SO42-杂质的测定。 吸收SO42-标准溶液（0.2mg/mL）1.0mL、2.0mL、3.0mL、 4.0mL、5.0mL，分别加入到25mL比色管中，各加入（1+1）HCl 1mL，乙醇5mL,10%BaCl2 5mL，分别加蒸馏水稀释至刻度，即为标 准色阶。 称样品1.000g溶于少量水中，过滤水不溶物，滤液加入25mL比 色管中，并吹洗滤纸，加1mL（1+1）HCl 消除CO32-，加5mL乙醇， 5mL,10%BaCl2 5mL，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，与色阶比较。假 设与第二个比色管浑浊度相同，则1g试样中含有0.4mg SO42-。 则 SO42-质量分数为：
第四节 比色法和分光光度法及其仪器
4.1 目视比色法
第十五章 比色法和分光光度法
分析：
A A bc bc 4
0.50 0.5 3.0103 / 125 1
4.2 10 ( L mol
cm )
1
例：有一Fe3+ 标准溶液，浓度为6μg· L-1，测得吸 光度A为0.304。另一含Fe3+ 的有色溶液，在同一 条件下测得吸光度 A为0.510，求试样中的含铁量 (mg· L-1)。 分析：
12.1.2 物质对光的选择性吸收
2 物质的颜色与光吸收
1) 固体物质：当白光照射到物质上时，物质对于不同波长 的光线吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现 出不同的颜色。
(1)全吸收，物质呈现黑色； (2)全反射，物质呈现白色； (3)吸收程度差不多，物质呈现灰色；
(4)选择性地吸收某些波长的光， 由它所反射或透过光 的颜色来决定物质的颜色。从互补色中找；
2 读数误差 仪器测量误差有很多，如光强不稳，光不纯，光电池不 灵敏，比色皿、标尺的精度不够，及读数不准等。对于一台 给定的仪器来说，前面一些因素都已经确定，只有读数是可 变的，所以读数误差是衡量准确度的主要因素。 由于T是均匀刻度，△T是一定的, A＝－lgT，A不均匀， △ A 不一定，而测量浓度的误差 是由 决定的。
红
白 青
橙 黄 绿
互补色:如果把适当颜色的两种单色光 按一定的强度比例混合,也可以得道多 助白光,这两种单色光叫做互补色光.
12.1.2 物质对光的选择性吸收
1 物质对光产生选择性吸收的原因 如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处， 则什么颜色也看不到。可见物质呈现的颜色与光有着 密切的关系，一种物质呈现何种颜色，是与光的组成 和物质本身的结构有关的。 物质对光的吸收并不是随意的。物质的结构不同具有 不同的能级，只有光量子的能量与物质的能量相吻合时 才吸收这种能量（波长）的光，物质吸收一定波长的光 就显示出他的互补色。
分光光度法与比色法
1、几个概念：分光光度法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
比色法colorimetry以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。
比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。
选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。
常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。
试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。
与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。
但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。
比色法与紫外分光光度法的异同
比色法与紫外分光光度法的异同比色法和紫外分光光度法，这俩听上去好像很复杂的科学名词，其实它们都跟“测量颜色”有关系。
嗯，简单说就是看东西的颜色，然后通过这个颜色来判断里面有什么成分。
你可能会想，这俩是不是差不多？是的，差不多，但细节上还是有点不同的，了解清楚了，能让你在实验室里也能像个小专家一样，得心应手。
比色法嘛，简单来说，就是通过溶液的颜色来判断它的浓度。
比方说，你往水里加了某种化学物质，水的颜色可能会变得更加浓烈。
你通过比较颜色的深浅，来推算浓度。
你觉得有点意思吧？其实这就像你平时看着一杯饮料的颜色，越深可能说明加糖多，越浅可能说明糖少，做化学实验也是一样。
可是，比色法有个小问题就是它受光线、溶液颜色、试剂浓度等各种因素的影响，哎，这就让它的准确性有点小小的波动。
紫外分光光度法呢，就像是比色法的“升级版”，有点像拿着超级显微镜来看问题。
它的原理是通过紫外线光源照射样品，然后测量样品吸收了多少光，最后得出结论。
简而言之，紫外线比可见光更“强”，它能穿透更多的东西。
所以，紫外分光光度法通常用来测量那些对紫外线有吸收的物质，比如药物中的有效成分，或者环境中的污染物。
这种方法不仅能量度颜色的深浅，还能更精确地定量物质的含量。
比色法和紫外分光光度法，最大的不同就体现在它们对光的“利用”上。
比色法主要依赖的是可见光，而紫外分光光度法则是通过紫外光去探测物质的特性。
就像你用手电筒和紫外线手电筒照东西，两者照出来的效果完全不一样。
比色法的测量范围一般限制在了肉眼能看到的颜色范围内，所以它适合一些比较简单的、颜色鲜明的实验；紫外分光光度法就不一样了，紫外光波长比可见光短，能“看到”更深层的东西，能测量更多“看不见”的物质。
所以，紫外分光光度法在处理一些微量物质或者需要高精度测量的场合，表现得更有“压倒性优势”。
不过，说到优缺点，它们俩也各有千秋。
比色法简单易用，设备不复杂，花费也相对便宜。
你只需要准备一个比色皿，把样品放进去，然后在一定的波长下对比颜色，就可以得出浓度。
第十二章比色分析和分光光度法
物质的颜色与光的关系 光谱示意 复合光 表观现象示意
完全吸收
黑色
白色
完全透过
蓝色
吸收黄色光
三 光吸收曲线或吸收光谱曲线
• 光吸收曲线或吸收光谱曲线
摩尔吸光系数ε的讨论
（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定 该物质的灵敏度越高。ε>105：超高灵敏；
ε=(6～10）×104 ：高灵敏； ε<2×104 ：不灵敏。 （6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该 溶液在某一波长下的吸光度。
3.偏离朗伯—比耳定律的原因
单色器
作用：将复合光色散成单色光
棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅
பைடு நூலகம்
样品池 玻璃，光学玻璃，石英
检测器
作用：将光信号转换为电信号，并放大
光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄 像管（多道分析器）
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
(2) 化学性因素
• 朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互 作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。
当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等 相互作用，直接影响了对光的吸收。 • 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。
溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等 化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 • 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：
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即： A lg I0 lg 1 kb
I
T
A为吸光度; I0为入射光强
I为透过光强; T为透光度
I0
I
k’为比例常数
b为液层厚度（光程长度） b
➢ 比耳（Beer）定律：
一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与 吸光物质微粒（分子）的数目（浓度c）成正比。即：
A lg I0 kc I
价电子能级的能量＋振动能级的能量＋转动能级的能量 能级差与对应的光谱
价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。
吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发
工作曲线（标准曲线）：
测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一 曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比。 ➢理想情况下工作曲线过原点； ➢直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要 求两个数量级以上的线性范围； ➢样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。
偏离比耳定律： 即工作曲线在高浓度端发生偏离。
2. 分光光度计的基本部件
检
结
光 源
单 色 器
吸 收 池
测 系 统
果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000um 10um
波 长
100nm 10nm
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm 橙 590 － 620nm 黄 570 － 590nm 绿 550 － 570nm 青 495 － 550nm 蓝 450 － 495nm 紫 380 － 450nm
第二十章 比色法和分光光度法
20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法
20.1 概述
20.1.1 分（吸）光光度法及其特点 比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点： ➢ 灵敏度高。10-3 －10-6 mol/L。 ➢ 准确度高。相对误差2－5％。 ➢ 仪器设备简单、操作简便。 ➢ 应用范围广。
➢ 朗伯-比耳定律：A kbc
当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸
光系数，其单位为cm-1mol-1L。
A bc
的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。
A bc
思考：摩尔吸光系数如何测定？
朗伯-比耳定律的适用范围： ➢不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光 物质和固态吸光物质； ➢它是各种吸光光度法定量分析的依据。
吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，被吸收的光的比例。
吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射 光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线。
最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱 曲线上的最大峰值。
Absorbance(AU)
0.6 1 0.5色散元件、聚焦透镜 和出射狭缝构成。
➢玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长 范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ） 则可用于整个紫外-可见光区。
➢光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围 宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而 产生相互干扰。
190－400nm
2. 可见光吸收光谱
➢单色光：单一波长光 黄
➢复合光：复合波长光
绿 青
➢互补光：处于同一直
线上的两种光。
橙
白光
青蓝
➢互补光按一定强度比 例混合，即得白光。
➢溶液颜色：互补光的 颜色。
红
蓝
紫
光的互补色示意图
3. 吸收光谱曲线
透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶 液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例。
态能级，因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以
光子的形式释放能量，从而产生发射光谱。
紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，
从基态跃迁到激发态。
20.2 光吸收定律
➢ 朗伯（Lambert）定律：一束单色光通过吸光物质的
溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度成正比。
吸收池（比色池、比色皿）： ➢用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 ➢因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 ➢杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差。 检测系统：
0.3 4
0.2
0.1
2
0
-0.1
190
240
290
340
390
wavelength(nm)
四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图
1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯
4. 物质吸收光的本质
物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动；
分子自身的转动。 分子的能量
20.3 比色法和分光光度法及其仪器
1. 光度分析方法 ➢ 目视比色法： ➢ 光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的
吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光； ➢ 分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准 溶液的吸光度。
分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。
偏离比耳定律的原因：
比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无 相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略。
入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件（单色器） 很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带， 而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。
化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、 悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增 大）。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。