选修3 动物的克隆(75张PPT)

• 淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡；DNA的主要合成途径被A阻断。
• 骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的旁路 途经受阻。
• 骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞，可长期生长繁殖。利用淋巴 细胞的HGRT将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA。从淋巴细胞 获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目
植物组织培养 动物细胞培养
原理
细胞的全能性
培养基性质 固体培养基
培养基特有成分 蔗糖 植物激素
细胞增殖 液体培养基
葡萄糖 动物血清
培养结果 培养目的
植物体
细胞株、细胞系
快速繁殖、
获得细胞或细
培育无病毒植株 胞分泌蛋白
动物的细胞融合技术及其应用
动物细 胞融合
抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗 原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
2.什么细胞可产生分泌型抗体？
效应B细胞
3.B淋巴细胞与抗体的关系
a.B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 b.动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体， 每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 c.每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。
• 用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷 型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT 培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下， 尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。
• 因此，只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。
3.动物细胞培养和组织培养的联系
两者在一定程度上可看作是同义语，统称为组织培养 （组培），即代表各种生物体结构成分的体外培养。
广义的组织培养还包括器官培养，即器官的原基、器 官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保 存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力。
动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞，
1.1885年，鸡神经板在生理盐水“中组培织养培成养活”。一词产生
2.1903年，皮肤及白细胞在腹水及血清中存活一个月， 且观察到细胞分裂。 3.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴真液正中的悬组浮织培培养养，开成始功； 看到神经末端的阿米巴运动。 创立了悬浮培养法
4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚成心功脏进组行织了块传进代行培原养代；培养
的表面上生长和分裂。
贴壁生长后随细胞数目的增多，会出现接触性抑制的 现象。 要定期要胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁脱离，配成 悬浮液，分装多瓶再培养
6、用胰蛋白酶处理动物胚胎或幼龄动物的组织、器官？ 分解胶原纤维等蛋白
7、若一直在卡氏瓶中持续培养会出现什么情况？
贴壁生长以及接触抑制生长的细胞就会因细胞密度过大 和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。
有关概念:
细胞系— 可连续传代的细胞 （1）有限细胞系： 不能连续培养下去的细胞系
例：二倍体细胞 （2）连续细胞系: 能连续培养ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ去的细胞系
大多数具有异倍体核型，有的是恶性细胞系，具有异 体致瘤性，有的获得不死性（保留接触抑制，不致癌）
细胞株-通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细胞
系中获得的具有特殊性质的细胞
原代培养
原代培养物 选择或纯化 细胞株
CO2培养箱中 保温培养
分装到多个卡氏瓶中 传代培养
细胞系
选择或纯化
细胞株
动物细胞培养中卡氏瓶为什么要放在5%CO2培养箱，明明有盖 子？ 放入二氧化碳培养箱时，瓶口不是完全封死的。（对大多数以 碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH， 培养箱中的二氧化碳需要维持在5%左右，以保持培养液中溶解 的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气， 以便于气体的交换。）
机械消化或胰酶消化 （胰蛋白酶）
动物组织细胞间 隙中含有一定量的 问题：胶为原什纤么维要等从原蛋代白培质养，转向传代培养？ 原代培将养细的胞细网胞络，起到一来定形时期时，贴壁生
单个细胞悬浮液
长以及接触成抑具制有生一长定的细弹胞性就和会因细胞密度过
转入特殊培养液 大和代谢消韧耗性引的起组营织养枯和竭器，官不。能正常生长。
使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一 样呈现一定的组织特性。
组 动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持 织 生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最 培 终成为细胞培养。 养
动物器官培养：体外培养动物器官原基、部分
或整个器官，使之得以保存、生长。保持器官的 结构、功能及分化能力。
（三）动物组织培养技术的发展
二氧化碳培养箱
通过在培养箱内模拟形成一个类似细 胞或组织在生物体内的生长环境，如恒 定的pH值（7.2-7.4）、稳定的温度 （37°C）、较高的相对湿度（95%）、 稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组 织进行体外培养的一种装置。
…………
小结：培养过程
从动物胚胎或幼龄动物组织 切片中取小片样品
• 利用肿瘤细胞无限增殖的特性
？
• 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具 有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞
• 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞
如何筛选？
促进融合的技术手段，那种融 合方法是动物细胞融合特有的？
融合后培养体系中的细胞种类 有几种？
筛选杂交细胞的方法？
①首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞： 筛选的目的：获得杂交瘤细胞。 筛选的方法： 用选择性培养基来完成，即 HAT培养基。
正常细胞
接触抑制
癌细胞
（2）动物细胞培养的条件
1）离体
2）营养物质：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、
动物血清
3）恒温和pH，无需光照 4）无菌无毒的环境
保证细胞顺利 的生长增殖
培养条件：
1. 培养基营养物质：氨基酸、糖类、维生素、无机盐、激素、其他成分（生长因子 【添加动物血清】）
2. 气体：CO2 O2【 CO2 培养箱：5% CO2和95%的空气 ，培养时培养瓶的盖子 处于拧松状态】 CO2的作用：调节PH 3. 理化条件：PH【 5% CO2调节PH ，培养基中加入PH缓冲剂，培养过程中细胞代 谢产生很多酸性物质，PH发生改变，为了实时监控培养基中PH的变化，一般在培养 基中加入酚红指示剂，若培养基颜色变化超过一定程度，即使细胞密度不大，也要更 换培养基。 】、渗透压、温度、湿度【 CO2 培养箱：37℃，湿度很高】 4. 无菌条件
细胞A
细胞B
物理法 化学法
灭活的病毒 仙台病毒
杂种细胞
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
病毒颗粒 细胞核
细胞核
诱导细胞融合物质：
诱导剂：灭活的仙台病毒、聚乙二醇
思考讨论： 1.为什么细胞融合过程需要使用灭活的病毒？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子 和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
有限细胞株 连续细胞株
具有恒定的染色体组型、同工酶类 型、病毒敏感性和生化特性。
（四）克隆培养法
1.定义：
把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之 繁衍成一个新的细胞群体的技术
2.产物: 遗传性状均一、表现的性状相似的纯系
未经克隆的异质性细胞系 克隆
纯系：经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源 于一个共同的祖细胞。
筛选杂交瘤细胞
筛选产生特定抗 体的杂交瘤细胞
②再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 通常采用有限稀释克隆细胞的方法，
5. 大部分细胞是贴壁细胞，需要一个可贴附的表面【细胞培养瓶或卡氏瓶的壁，培养 皿的壁】，会接触抑制，培养密度不能过大。 少部分细胞是悬浮细胞，悬浮培养，悬浮细胞的密度可远远大于贴壁细胞，因此利用 动物细胞进行工业大规模生产一些药物时，最好使用悬浮细胞。
（3）动物细胞的培养过程
取动物胚胎 或幼龄动物器官
2.细胞融合过程中使用的病毒不灭活，行吗？ 不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合
3.细胞融合就是细胞杂交吗？
细胞融合是可以要基因型相同或不同的细胞间进 行，其中基因型不同的细胞间的融合叫细胞杂交
4.细胞融合技术应用于哪些方面？ 细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。
单克隆抗体
1.什么是抗体？
和组织
因为这些组织或器官上的细 胞生命力旺盛，分裂能力强
剪碎组织
分解组织中的胶 原纤维和细胞外 的其他成分
胰蛋白酶处理
单个细胞
细胞培养
（4）动物细胞生长特点： 1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞，紧贴培养 瓶内壁才能生长； 2）接触抑制：当培养瓶中贴壁生长细胞彼此紧密接 触时，细胞不再分裂； 3）细胞只分裂不分化。
3.细胞克隆的基本要求:
必须保证所建成的克隆来源于单个细胞
4.适合于克隆的细胞：
对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞
群体细胞> 单细胞
无限细胞系、转化或肿瘤细胞 >原代细胞、有限细胞系
5.提高细胞克隆形成率的措施：
•选择适宜的培养基 •添加血清 （胎牛血清） (能促进细胞的生长、增殖和贴附) •以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞） •激素刺激（胰岛素等） •使用CO2培养箱，调节PH
（5）动物细胞培养的结果： 不能最终培养成生物体,而是细胞群。
思考：
1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独 特之处？ 主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特 之处有：a、液体培养基 b、成分中有动物血清等 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养 材料？
因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
5、培养的细胞为什么会贴壁生长？ 大多数组织细胞不适应悬浮生长，他们必须在固体
动物克隆的技术基础： 动物的细胞培养 和组织培养
植物克隆的技术基础： 植物组织培养
一、动物细胞的培养和克隆形成
（一）动物细胞
1、动物细胞培养
为什么要分散成单个细胞培养？
（1）定义
将动物体内的一部分组织取出
机械消化或胰酶消化
分散成单个细胞
放在适宜的培养基培养
细胞得以生存并保持生命活动现象
生存、生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等
• 选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT－）缺陷。
• 筛选的方法： 用选择性培养基来完成，即HAT培养基。加入次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称HAT培养基。
• 其中，氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应 急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶） 作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成 不能发生。
6.细胞克隆的主要用途：
从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。
用于研究细胞的遗传规律和生理特性。
C
• （2014浙江高考，3）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 B • A．连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型 • B．某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞 • C．由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆 • D．未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状
和传代培养。
发明了卡氏瓶；
5.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞
克隆。
标志着组织培养工作进入
6.1950年，人工培养液“199全”新研阶制段成功
7.1951年，海拉细胞系的建成。
原代培养
从机体取出后立即 进行的细胞、组织 培养
传代培养
原代培养细胞分成 若干份，接种到若 干份培养基中，使 其继续生长，增殖。
所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？ 怎样解决这个问题？
单克隆抗体
由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相 同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的 抗体称为单克隆抗体。
特点：化学性质单一、特异性强、灵敏度高
融
如何大量生产单克隆抗体？
合
方
• 利用淋巴细胞产生抗体的功能
式
（二）动物组织培养
1.概念：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。
动物组织培养过程中可以伴随组织分化。不管采用什么手段 和培养条件，组织培养中主要生命活动成分仍然以细胞为单位的。
2.结果：由于细胞的运动、变化，使得培养物的组织成分也发生结 构和功能变异，结果长期的培养经常只能使单一类型的细胞保存下 来，最终成了简单的细胞培养。