荧光偏振技术原理 ppt课件
荧光偏振技术介绍
62原理：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。
如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。
如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。
如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。
如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
如图2.图2 荧光偏振检测原理任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。
因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。
对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。
近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。
因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。
相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。
最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。
此外，荧光偏振所需的样品量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。
概述光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。
当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。
偏振原理及应用 ppt课件
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3、通过第一个偏振片的偏振光再通过第二个偏振片（称 为检偏器）时，如果两个偏振片的透振方向平行，那 么，通过第一个偏振光的振动方向跟第二个偏振片的 透振方向平行，透射光的强度最大．
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4、如果两个偏振片的透振方向垂直，那么，偏 振光的振动方向跟第二个偏振片的透振方向垂 直，偏振光不能通过第二个偏振片，透射光的 强度为零．
2. 马吕斯定律: I I0 co2s
四、偏振光的应用实例
立体电影、汽车车灯、生物视觉、激光器的谐振腔、
等等
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• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
2、实验：
• 取一根软绳，一端固 定在墙上，手持另一 端上下抖动，就在软 绳上形成一列横波.
现在，让软绳穿过一块带有狭缝的木板，如果狭缝 与振动方向平行，则振动可以通过狭缝传到木板的 另一侧（图甲）．如果狭缝与振动方向垂直，则振 动就被狭缝挡住而不能向前传播（图乙）．
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5
• 如果将这根绳换成细软的弹簧，前后推动弹簧 形成纵波，则无论狭缝怎样放置，弹簧上的纵 波都可以通过狭缝传播到木板的另一侧（如下 图）．
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6
受上面实验的启发，我们 可以利用类似的实验来判断光
波是横波还是纵波．
• 偏振片由特定的材料制成，它上面有一个特殊的 方向（叫做透振方向），只有振动方向与透振方 向平行的光波才能通过偏振片．偏振片对光波的 作用就像上图中的狭缝对于机械波的作用一样．
• 现在利用偏振片代替上面的带有狭缝的木板，来 做光学实验．
荧光偏振法
荧光偏振法荧光偏振法是一种用于研究生物大分子结构与功能的非常有用的技术手段。
荧光偏振法是利用荧光分子的特性来进行研究，荧光偏振法可以用于研究分子间的相互作用、分子内部结构的确定以及蛋白质的折叠状态等方面的问题。
以下是对荧光偏振法的详细介绍。
一、荧光偏振法的基本原理荧光偏振法是利用偏振光与荧光分子之间的相互作用来实现的。
荧光分子通常在能量激发后能够发出荧光，而荧光分子的发出方向与激发光的方向之间存在一定的关系。
因此，当将荧光分子暴露在偏振光的作用下时，在荧光发出时，会观察到特定的荧光偏振性质，这些性质可以用来研究分子结构、动力学和函数方面的问题。
荧光偏振法的基本原理可以通过极化法与偏振法来进行分析。
这些方法利用荧光分子的极化来探测荧光分子的偏振性质。
在极化法中，荧光分子处于热平衡状态下，因此，在具有不同极化方向的偏振光激发下，荧光分子发射的荧光强度也会发生变化。
在偏振法中，荧光分子产生的荧光偏振性质被用来研究分子的构象和方向性的问题。
二、荧光偏振法的优势荧光偏振法有很多的优势，包括以下几点：1. 荧光偏振法可以研究分子的结构和函数。
荧光偏振法可以通过测量荧光偏振性质来研究分子的结构和函数，这使得荧光偏振法成为了一个非常有用的技术手段。
2. 荧光偏振法具有高灵敏度和高分辨率。
荧光偏振法的灵敏度和分辨率都非常高，这使得荧光偏振法成为了一种非常重要的技术手段。
3. 荧光偏振法可以研究生物大分子的互作用。
荧光偏振法可以用来研究生物大分子的互作用，如蛋白质之间的相互作用、蛋白质-核酸相互作用等，这些研究对于研究生物大分子的结构和功能都非常重要。
三、荧光偏振法的应用荧光偏振法在生命科学研究中经常被使用。
荧光偏振法在蛋白质研究、膜研究、DNA/RNA研究、细胞动力学研究等方面都有广泛应用。
1. 荧光偏振法在蛋白质研究中的应用。
荧光偏振法可以用来研究蛋白质的结构和功能。
荧光标记的蛋白质可以用来研究其折叠状态、构象变化和互作用等方面的问题。
《光的偏振实验》课件
椭圆偏振是指光在传播过程中，其电矢量在垂直于传播方向的平面上作椭圆运动。
偏振光通过不同介质的现象
偏振光通过透明介质时，其偏振方向会发生改变 偏振光通过反射介质时，其偏振方向也会发生改变 偏振光通过折射介质时，其偏振方向也会发生改变 偏振光通过散射介质时，其偏振方向也会发生改变
观察干涉条纹：记录干涉 条纹的变化，分析光的偏 振特性
实验总结：总结实验结果， 分析光的偏振特性，得出 结论
实验注意事项
确保实验环境 安全，避免光
线直射眼睛
实验过程中， 注意保护实验 器材，避免损
坏
实验过程中， 注意观察实验 现象，及时记
录数据
实验结束后， 及时清理实验 器材，保持实
验室整洁
光的偏振实验结果分析
光的偏振实验原理
光的波动理论
光的波动性：光具有波动性，可以传播和反射
光的偏振：光在传播过程中，其振动方向与传播方向之间存在一定的关系
光的偏振实验：通过实验观察光的偏振现象，验证光的波动性
光的偏振原理：光的偏振是由于光在传播过程中受到介质的影响，导致其振动方向发生变 化
光的偏振态
光的偏振态是指光在传播过程中，其电矢量在垂直于传播方向的平面上的振动状 态。 光的偏振态可以分为线偏振、圆偏振和椭圆偏振三种。
光的偏振的应用
光学仪器中的偏振现象
偏振片：用于改变光的偏振状态，如偏振显微镜、偏振相机等 偏振棱镜：用于分离不同偏振方向的光，如偏振分光镜、偏振棱镜等 偏振光栅：用于分析光的偏振特性，如偏振光栅、偏振光栅相机等 偏振干涉仪：用于测量光的偏振特性，如偏振干涉仪、偏振干涉显微镜等
摄影技术中的偏振应用
偏振X射线荧光分析培训教程39页PPT
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
偏振X射线荧光分析培训教程
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
荧光偏振分析方法
02
通过实时监测荧光标记信号分 子的偏振状态，可揭示信号传 导过程中的分子事件和调控机 制。
03
荧光偏振技术还可用于研究细 胞间信号传导和细胞通讯过程 ，为理解细胞行为和生理功能 提供新的视角。
04
荧光偏振在材料科
学中应用
高分子材料结构与性能关系研究
荧光偏振用于研究高分子 链构象
通过荧光偏振技术可以观察高分子链在不同 条件下的构象变化，进而理解其物理性质和 化学性质。
数据处理
对采集到的数据进行处理和分析， 包括数据清洗、归一化、统计分 析等步骤，以提取有用的信息并 得出结论。
结果展示
将处理后的数据以图表、图像等 形式展示出来，以便更直观地理 解和解释实验结果。
03
荧光偏振在生物医
学领域应用
药物筛选与评估
1
荧光偏振技术可用于高通量药物筛选，通过测量 荧光标记药物与靶标结合后的偏振变化，快速识 别潜在活性化合物。
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荧光偏振分析方法
目录
CONTENTS
• 荧光偏振原理及基本概念 • 荧光偏振实验技术与方法 • 荧光偏振在生物医学领域应用 • 荧光偏振在材料科学中应用 • 荧光偏振在环境监测领域应用 • 荧光偏振技术发展趋势与挑战
01
荧光偏振原理及基
本概念
荧光产生与发射过程
荧光物质吸收光能
荧光物质在受到特定波长的光照射时，会吸收光能并激发电子从 基态跃迁到激发态。
01
利用荧光偏振技术可以快速筛选具有特定功能的材料，如发光
材料、光电材料等。
荧光偏振用于功能材料性能优化
02
通过荧光偏振技术可以研究功能材料的性能与结构之间的关系，
荧光偏振技术原理
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
MAP探针
Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8386-8389.
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
汞离子检测荧光偏振探针检测限达到0.2 ppb ，比传统荧光偏振方法提高2个数量级，检测 时间只需20分钟，具有良好的特异性
AuNP hancement
AuNP-DNA System 0.2 ppb
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
5. 小分子分析
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
1 1 ( 1 1)(1 RT ) P 3 P0 3 V
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
§2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料的生物功能化方法
非共价功能化途径
静电相互作用 π-π堆积作用 范德华力
荧光偏振免疫测定的原理
荧光偏振免疫测定的原理
荧光物质经单一平面的偏振光蓝光(波长485nm)照射后，可吸收光能跃入激发态;在恢复至基态时，释放能量并发出单一平面的偏振荧光(波长525nm)。
偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。
大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强;小分子物质旋转快，其偏振荧光弱。
利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定，用于小分子物质特别是药物的测定。
FPIA的试剂为荧光素标记的药物和抗药物的抗体，模式为均相竞争法，标本中的药物与荧光标记的药物与一定量的抗体竞争结合。
反应平衡后，与抗体结合的荧光标记药物的量与标本中药物浓度的量呈反比。
由于抗体的分子量远大于药物的分子量，游离的荧光标记药物与结合抗体的荧光标记药物所产生的偏振荧光强度相差甚远。
因此在F PIA中测定的偏振荧光强度与标本中药物的浓度呈反比。
荧光偏振技术原理课件PPT
5. 小分子分析
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
P 11 3(P 101 3)1(V RT )
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
Polarized excitation
100% 0%
<100% >0%
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏振值的定义
P= +
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = 1；对于自然光，P = 0
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
➢ 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
荧光偏振免疫分析原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
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§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 小分子检测
蛋白质增强荧光偏振
荧光偏振技术原理
凝血酶 (thrombin)
Anal. Chem. 2012, 84, 5535-5541.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 离子检测
特殊结构核酸增强荧光偏振
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
➢ 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
➢ 分子旋转ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
偏振值衡量荧光分子的运动性
5. 小分子分析
荧光偏振技术原理
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
荧光偏振技P 术1原理 1 3(P 10 1 3)1(V RT )
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
荧光偏振技术原理
荧光偏振免疫分析原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
荧光偏振技术原理
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
Polarized excitation
100% 0%
荧光偏振技术原理
<100% >0%
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏振值的定义
P= +
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = 1；对于自然光，P = 0
荧光偏振技术原理
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
荧光偏振技术原理
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
Chem. Commun. 2011, 47, 3478-3480.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
荧光偏振技术原理
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
荧光偏振技术原理与 仪器及其应用
荧光偏振技术原理与仪器及其应用
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
荧光偏振技术原理
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
荧光偏振技术原理
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
荧光偏振技术原理
荧光偏振技术原理
Analyst, 2012, 137, 2770-2773.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理 Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
超灵敏检测DNA
3. 核酸分析
荧光偏振技术原理
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 荧光偏振技相术原检理测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。