荧光偏振技术原理 ppt课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Chem. Commun. 2011, 47, 3478-3480.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
荧光偏振技术原理
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
荧光偏振技术原理与 仪器及其应用
荧光偏振技术原理与仪器及其应用
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
荧光偏振技术原理
5. 小分子分析
荧光偏振技术原理
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
荧光偏振技P 术1原理 1 3(P 10 1 3)1(V RT )
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
荧光偏振技术原理
荧光偏振免疫分析原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
荧光偏振技术原理
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
Polarized excitation
100% 0%
荧光偏振技术原理
<100% >0%
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ值的定义
P= +
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = 1；对于自然光，P = 0
荧光偏振技术原理
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
荧光偏振技术原理
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 小分子检测
蛋白质增强荧光偏振
荧光偏振技术原理
凝血酶 (thrombin)
Anal. Chem. 2012, 84, 5535-5541.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 离子检测
特殊结构核酸增强荧光偏振
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 荧光偏振技相术原检理测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理 Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
超灵敏检测DNA
3. 核酸分析
荧光偏振技术原理
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
荧光偏振技术原理
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
荧光偏振技术原理
Analyst, 2012, 137, 2770-2773.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
➢ 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
➢ 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
偏振值衡量荧光分子的运动性
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
3. 核酸分析
实时监测DNA双链的形成和解链过程
荧光偏振技术原理
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
荧光偏振技术原理与 仪器及其应用
荧光偏振技术原理与仪器及其应用
1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
非偏振光原理图
光的偏振性
自然光在各个方向 振动是均匀分布的
偏振光原理图
一束光线都在同一 方向上振动
荧光偏振技术原理
5. 小分子分析
荧光偏振技术原理
Chem. Commun. 2012, 48, 10004–10006.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
传统荧光偏振分析技术面临的挑战： 荧光偏振变化量较小，灵敏度较低
解决的方案
荧光偏振技P 术1原理 1 3(P 10 1 3)1(V RT )
MAP探针 (Mass Amplifying Probe)
荧光偏振技术原理
荧光偏振免疫分析原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
2. 蛋白质-核酸相互作用
核酸适配体 (aptamer) 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质、小分子、 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修饰、稳定性好、成 本低，已广泛应用于分析应用领域
荧光偏振技术原理
荧光偏振分析的一般步骤
• 利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前 后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析。
• 如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振 光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位 mP）。
光的偏振特性，也就是所谓的荧光去偏振现象。
Polarized excitation
100% 0%
荧光偏振技术原理
<100% >0%
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
如何衡量：偏ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ值的定义
P= +
偏振值一般以mP（毫偏）来表示
对于完全偏振发射，P = 1；对于自然光，P = 0
荧光偏振技术原理
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
荧光偏振技术原理
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 小分子检测
蛋白质增强荧光偏振
荧光偏振技术原理
凝血酶 (thrombin)
Anal. Chem. 2012, 84, 5535-5541.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 离子检测
特殊结构核酸增强荧光偏振
K+的作用
一. 调节机体和细胞的渗透压 二. 调节体液的酸碱平衡 三. 参与体内蛋白质和糖类的代谢 四. 维持正常的神经兴奋性和心肌运动
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 荧光偏振技相术原检理测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述 国内外研究现状及发展动态分析
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析法 (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是一种定量免疫分析技术。
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
荧光偏振
（Fluorescence Polarization，FP）
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性； 如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发
传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质-核酸相互作用的原理 Biosens. Bioelectron. 2012, 32, 148-154.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
超灵敏检测DNA
3. 核酸分析
荧光偏振技术原理
改进传统的荧光偏振检测方 法，通过引入酶促反应扩增检测 信号应用于超灵敏检测特异性 DNA的检测。
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
荧光偏振技术原理
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
多元检测方法
荧光偏振技术原理
Analyst, 2012, 137, 2770-2773.
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
特殊结构核酸增强荧光偏振
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化 分析领域。
20世纪80年代，随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化，荧光偏振技术在 生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色。
荧光偏振技术原理
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
§1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
偏振值的影响参数
➢ 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，分子旋转弛豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间；
➢ 分子旋转弛豫时间与介质黏度、绝对温度、分子体积和分子重量和气体常 数有关。
P 11 3(P 10 1 3)1(V RT )
偏振值衡量荧光分子的运动性