第八章分子标记及其应用
分子标记技术的原理和应用
分子标记技术的原理和应用1. 简介分子标记技术是一种用于标记和检测生物分子的方法。
通过在目标分子上引入特定标记物，可以实现对这些分子进行定量、定位及特异性检测。
本文将介绍分子标记技术的原理和应用。
2. 原理分子标记技术主要通过以下步骤来实现对目标分子的标记和检测：•选择标记物：标记物通常是具有特异性的分子或结构，如荧光染料、酶、金纳米颗粒等。
根据标记物的特性和应用需求，选择合适的标记物。
•引入标记物：将选定的标记物与目标分子进行结合。
这可以通过化学反应、酶促反应或物理吸附等方法实现。
•检测标记物：使用适当的检测方法，如光谱分析、电化学方法等，对标记物进行定量或定性检测。
这些方法可以根据标记物的特性和需求选择。
3. 应用分子标记技术在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：3.1 生物医学研究•免疫组织化学：通过标记特定抗体来检测组织中的蛋白质，用于研究疾病诊断、治疗反应和组织学研究。
•分子诊断：使用分子标记技术检测体液中的特定生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，用于早期疾病诊断和个体化治疗。
•药物研发：利用分子标记技术对药物与靶标的相互作用进行研究，加速药物研发过程。
3.2 食品安全检测•农药残留检测：使用分子标记技术检测食品中的农药残留物，保证食品安全。
•食品成分分析：通过标记特定分子，检测食品中的成分和添加物。
3.3 环境监测•水质检测：使用分子标记技术检测水中的有害物质和污染物，保护环境和人类健康。
•大气污染监测：通过标记特定分子，检测大气中的污染物，评估空气质量。
3.4 基因组学研究•基因定位：使用分子标记技术对基因组中特定序列进行定位和研究。
•基因表达分析：通过标记RNA或蛋白质，研究基因在各个组织中的表达情况。
4. 总结分子标记技术以其高灵敏度、高特异性和高可视性等优势，在生物医学研究、食品安全检测、环境监测和基因组学研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，相信分子标记技术将在未来发挥更大的作用，并为各个领域的研究和应用带来更多的突破。
分子标记技术原理方法及应用
分子标记技术原理方法及应用分子标记技术是一种用于检测和定位特定分子的方法。
其原理是通过将一种特殊的化学物质（标记物）与目标分子结合，然后利用标记物的性质来对目标分子进行分析和检测。
分子标记技术被广泛应用于生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域。
常用的分子标记技术有荧光标记、酶标记和放射性标记等。
荧光标记是一种将目标分子与荧光染料结合的技术。
荧光标记的原理是通过荧光染料的特性，使得目标分子在荧光显微镜下显示出特定的荧光信号，从而对其进行定位和分析。
荧光标记可以在细胞、组织和体内进行，具有灵敏度高、分辨率高和实时监测的优点。
常见的荧光标记方法有间接免疫荧光标记、原位杂交荧光标记和荧光蛋白标记等。
荧光标记技术广泛应用于细胞定位、蛋白质相互作用研究、细胞分析和分子诊断等领域。
酶标记是一种利用酶与底物反应的方法进行分子标记。
通常，酶标记将目标分子与特定的酶（如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）结合，然后通过对底物的催化作用产生显色或荧光信号。
酶标记在生物学检测中得到广泛应用，特别是在酶联免疫吸附试验（ELISA）中。
酶标记具有灵敏度高、稳定性好的特点，可以用于检测蛋白质、核酸和小分子等生物分子。
放射性标记是利用放射性同位素与目标分子结合的技术。
放射性同位素具有高灵敏度和长时间半衰期的特点，可以用于追踪和测定目标分子的存在和分布。
放射性标记技术广泛应用于细胞和分子影像学、放射性定位和药物代谢等领域。
分子标记技术在生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域有着广泛的应用。
在生物医学研究中，分子标记技术可以用于研究细胞和分子的结构和功能，探索疾病的发生机制和药物的作用机理。
在生物学检测中，分子标记技术可以用于检测和定位特定的生物分子，如蛋白质、核酸和小分子等，从而实现对生物过程的观察和分析。
在药物研发中，分子标记技术可以用于筛选和评价药物的活性和毒性，以及研究药物的代谢和药理学特性。
总之，分子标记技术的发展和应用为生物医学研究和生物学检测提供了强大的工具，有助于我们深入理解生命的奥秘和开发有效的治疗手段。
分子标记技术原理方法及应用-图文
分子标记技术原理方法及应用-图文一、遗传标记的类型及发展遗传标记(geneticmarker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。
形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点:形态学标记简单直观、经济方便。
缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)多态性较差，表现易受环境影响;(3)有一些标记与不良性状连锁;(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点:能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。
缺点:(1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大;(2)有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。
分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点:直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。
缺点:(1)目前可使用的生化标记数量还相当有限;(2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。
(1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；几种主要的ＤＮＡ分子标记二、几种常见分子标记的原理及方法1.RFLP2.RAPD3.AFLP4.SSR5.ISSR6.SNP1.RFLP：RetrictionFragmentLengthPolymorphimbyBottein(1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。
《分子标记的应用》课件
通过检测犯罪现场遗留的生物样本中的分子标记，为犯罪调查提供 证据和线索。
遗传疾病研究
利用分子标记研究遗传性疾病的发病机制和家族遗传规律，为法医学 中的遗传疾病分析提供支持。
THANKS
分子标记技术的种类
01
限制性片段长度多态性（RFLP）
利用限制性内切酶切割基因组DNA，产生不同长度的片段，再通过电
泳和 Southern 杂交技术检测多态性。
02
微卫星标记
利用串联重复的DNA序列在不同个体间的变异来标记基因组，具有高
度多态性和遗传稳定性。
03
单核苷酸多态性（SNP）
检测单个核苷酸位点的变异，是最常见和应用最广泛的分子标记之一。
通过分子标记技术，可以鉴定 家禽品种间的遗传差异，为品
种选育提供依据。
分子标记还可以用于研究家禽 繁殖和生长等重要经济性状的 遗传基础，为育种提供理论支
持。
通过分子标记辅助选择，可以 快速准确地选择具有优良性状 的个体，提高家禽生产效益。
分子标记在兽医学中的应用
分子标记在兽医学中主要用于动物疾病诊断、抗病育种 和药物研发等方面。
利用分子标记技术快速筛选具有潜在活性的药物候选物，提高药 物研发效率。
药物靶点发现
通过研究分子标记与药物反应的关系，发现新的药物作用靶点， 为新药研发提供方向。
药物疗效评估
利用分子标记监测药物治疗过程中的生物标志物变化，评估药物 疗效和安全性。
分子标记在法医学中的应用
身份鉴定
利用DNA分子标记进行个体身份鉴定，在法医鉴定、亲子鉴定等领 域具有重要应用。
种群遗传多样性分析
分子标记可以揭示种群内的遗传变异，了解种群的遗传结构、变 异水平和进化历史。
生物信息学中分子标记分析及其应用
生物信息学中分子标记分析及其应用随着现代生物学技术的不断发展和普及，分子标记分析成为生物信息学领域中重要的研究内容之一。
它主要研究分子标记的表达和遗传变异规律，并结合各种信息技术手段对其进行数据挖掘和分析，可以为疾病预防、农业生产、环境保护等领域提供大量有用的信息资源。
本文将从分子标记的类型、鉴定方法、数据分析及其应用等方面进行介绍。
一、分子标记的类型分子标记根据其表达方式和遗传位点的不同，可以分为几种不同类型，包括：1. DNA序列标记：以DNA序列多态性作为标记，包括随机扩增多态性（RAPD）、扫描电子显微镜标记（SEM）、微卫星标记（SSR）等。
2. RNA序列标记：以RNA序列多态性作为标记，包括EST、cDNA-AFLP和SAGE等。
3. 蛋白质表达标记：以蛋白质表达多态性作为标记，包括同功酶（isozyme）、基质辅助激光解析/电喷雾离子化质谱（MALDI-TOF/MS）和蛋白质芯片（Protein microarray）等。
4. 表型标记：以表型多态性作为标记，包括性状标记（QTL）和候选基因标记等。
二、分子标记的鉴定方法对于不同类型的分子标记，其鉴定方法也有所区别，一般分为以下几类。
1. 电泳技术通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、直接序列分析或DNA芯片技术等将样品分离、检测或鉴定。
2. PCR扩增技术通过选择性扩增特定DNA或RNA序列，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳或直接测序等分析方法检测样品。
3. 单片断多态性分析（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）采用连续PCR扩增和测序技术对基因中的单核苷酸多态性位点进行鉴定。
三、分子标记的数据分析分子标记数据分析的主要任务是对不同标记的数据进行处理、剖析和比较，得出有用的结论。
分析方法和模型的不同将对研究结果产生巨大的影响。
1. 群体遗传学分析对群体中的不同分子标记进行统计、分析和比较，如遗传结构分析、分子遗传多样性分析、亲缘关系分析等。
《动物分子生物学》教学课件：第八章 动物的分子标记及应用
由于LD的存在，实际上只存在少数 几个常见的单倍型：
标签SNPs（haplotype tag SNPs, htSNPs）
⑥ 线粒体DNA（mtDNA)多态性
动物体内除了核基因组外唯一存在的核外DNA。 由于线粒体基因组序列变异快，具有高度多态 性，因此可以作为分子标记，用于亲缘关系的 判定和生物进化分析等。
➢ 鉴定某个体的基因型，被称为基因分型（genotyping）
SNP的单倍型
➢ 单倍型（haplotype）：也叫单体型，指位于 染色体上某一区域的所有SNP等位基因的集 合。
➢ 单倍型的理论数量：有n个SNPs，就有2n个 单倍型。
➢ 但由于连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）的存在，相邻SNP的等位位点倾向于以 一个整体遗传给后代。因此，一条染色体上 某一区域实际上只有少数几个单倍型。
分子标记种类
I 类标记： 出现在基因内部，影响到该基因的功能，进而影响性 状表现的分子标记。
II 类标记： 在基因外部，与基因功能无关的分子标记，也称为匿 名标记（anonymous marker）。如微卫星DNA标记。
常见的分子标记
• 限制性片段长度多态性 (Restricted fragment length polymorphisms, RFLP)
（5）分子标记（molecular marker）
分子标记（广义）是以个体间遗传物质内核苷酸序 列变异为基础的遗传标记，是 DNA 水平遗传多态性 的直接反映。也称DNA标记（狭义）。
DNA标记
等位基因
(Allele)
分子标记技术及应用
分子标记技术和应用一、基于DNA杂交技术的分子标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,DNA限制片段长度多态性) RFLP是以Southern杂交为核心,应用最早的分子标记技术。
RFLP首先是在人类基因组研究中发展起来的,主要用于遗传疾病诊断和法医鉴定，RFLP的概念由人类遗传学家Botstein等首次提出，其原理为:碱基的改变与染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA片段酶切位点的变化,用限制性内切酶切割改变的DNA,将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后就会呈现出不同的带状分布,而具有差异的DNA片段就可通过Southern杂交检测出来。
利用RFLP技术可进行遗传图谱构建、基因定位、数量性状基因座定位(QTL)及遗传多态性分析等。
RFLP标记具有下列优点：结果可靠，这是由于限制性内切核酸酶识别序列的专一性决定的。
结果稳定，RFLP标记无表型效应，其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响。
RFLP标记的等位基因间是共显性的，对选择隐形基因极为有利。
RFLP标记的非等位基因之间不存在基因互作，标记互不干扰。
RFLP起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，而且可利用的探针很多，可以检测到很多遗传位点。
但RFLP标记也有自身的不足：需要大量高纯度的DNA （5-10μg）。
所需仪器设备较多、检测步骤多、技术较复杂，周期长、成本高。
通常都用到同位素，对人体有一定的伤害。
具有种属特异性，且只适合单拷贝和低拷贝基因。
多态性产生的基础是限制性酶切位点的丢失或获得，所以RFLP多态位点数仅1或2个，多态信息含量低。
二、基于PCR技术的分子标记技术1.基于随机引物PCR的分子标记技术在聚合酶链式反应（PCR）技术发明后（1987年，Mullis和Faloona），由于PCR技术操作简单，成功率较高，出现了一大批以PCR技术为基础的分子标记。
分子标记的原理以及应用
分子标记的原理以及应用1. 介绍分子标记是一种将特定分子与其他分子进行区分和识别的方法。
通过将分子标记添加到目标分子中，可以将特定的分子与其他分子进行区分，从而实现分子的精确检测和定位。
分子标记具有广泛的应用，在药物研发、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
2. 分子标记的原理分子标记的原理基于分子的特定结构和性质。
通常，分子标记是通过在目标分子中添加特定的标记分子来实现的。
这些标记分子与目标分子之间有着特定的相互作用，可以通过这些相互作用来识别和定位目标分子。
2.1. 标记分子的选择选择合适的标记分子是分子标记的关键。
标记分子应具有以下特点：•与目标分子有着特定的相互作用•可以通过特定的检测方法进行识别•不会与其他分子发生干扰作用常用的标记分子包括荧光染料、放射性同位素、金纳米颗粒等。
这些标记分子可以通过与目标分子之间的相互作用实现对目标分子的检测和定位。
2.2. 分子识别和定位一旦目标分子与标记分子相互作用，可以通过特定的检测方法来识别和定位目标分子。
常用的检测方法包括荧光检测、放射性测量、质谱分析等。
通过将标记分子与目标分子结合，可以利用这些特定的检测方法实现对目标分子的精确检测和定位。
这种分子标记的原理可以广泛应用于各个领域，如药物研发、生物医学、食品安全等。
3. 分子标记的应用分子标记具有广泛的应用，在不同领域发挥着重要作用。
以下列举了一些常见的应用：3.1. 药物研发在药物研发过程中，分子标记可用于药物的筛选、定位和追踪。
通过将标记分子与目标分子结合，可以准确检测和定位药物分子在体内的分布和代谢情况，为药物研发提供重要的指导和支持。
3.2. 生物医学在生物医学领域，分子标记可用于细胞和组织的识别和定位。
通过将标记分子与细胞或组织中的特定分子结合，可以实现对细胞和组织的精确检测和定位。
这对于研究细胞和组织的结构、功能和病理变化具有重要意义。
3.3. 食品安全在食品安全领域，分子标记可用于检测和追踪食品中的有害物质和污染物。
分子标记的原理特点及应用
分子标记的原理特点及应用一、分子标记的原理分子标记是一种用于确定和定位特定分子的方法。
它基于分子中的特定结构或性质进行标记，并利用这些标记来进行分子的定位和识别。
常见的分子标记方法包括荧光标记、抗体标记和DNA标记等。
1. 荧光标记荧光标记是通过给分子引入荧光物质，使其发出特定波长的荧光信号来标记分子。
荧光标记的原理是将某种荧光物质或染料与目标分子结合，形成带有荧光信号的复合物。
荧光标记具有灵敏度高、实时性好等优点，广泛应用于药物研发、细胞生物学等领域。
2. 抗体标记抗体标记是通过给目标分子结合抗体，利用抗体的特异性和亲和性来对目标分子进行标记。
抗体标记的原理是将目标分子与特定的抗体结合，形成结合复合物。
抗体标记具有高度特异性和灵敏性，常用于生命科学研究和临床诊断等领域。
3. DNA标记DNA标记是利用DNA分子的特性对分子进行标记和检测。
DNA标记的原理是将目标分子与特定的DNA序列结合，形成带有DNA标记的复合物。
DNA标记常用于基因测序、分子诊断和基因工程等领域。
二、分子标记的特点分子标记具有以下几个特点：1. 高选择性分子标记的方法通常具有高度的选择性，可以根据目标分子的特定结构或性质进行标记。
这使得分子标记可以精确地定位和识别目标分子，减少误判和混淆。
2. 高灵敏度分子标记方法通常具有高度的灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标分子。
这使得分子标记成为很多科学研究和临床诊断中的重要工具，例如用于检测罕见疾病的基因突变。
3. 实时性分子标记方法通常具有较快的响应速度和实时性，可以实时监测和观察目标分子的变化。
这使得分子标记在动态过程观察和实时监测中具有重要意义，例如用于研究细胞信号转导的过程。
4. 多样性分子标记具有多样性，可以根据具体需求选择不同的标记方法和标记物质。
不同的标记方法可以针对不同的分子结构和目标分子进行标记，满足不同领域和研究的需求。
三、分子标记的应用分子标记在多个领域中得到广泛应用，包括生命科学研究、临床诊断、药物研发等。
DNA分子标记
AFLP具有以下特点： 1) AFLP标记的检测不受环境、季节和时间以及组织 部位和发育阶段的影响。可以用它在植株的早期鉴 定和预测。 2) AFLP可以对无任何分子生物学研究基础的物种进 行研究，不需要知道基因组DNA的序列就可构建其 指纹图谱。因此，AFLP适合于研究任何生物。 3) AFLP所需DNA用量少、反应灵敏、快速高效，适 合于大规模样品的研究。一个0.5mg的DNA样品就 可以做约4,000个反应。 4) AFLP指纹图谱多态性丰富，每个样品每次扩增反 应可产生50～150条带，用最少量的引物就能获得 最多的标记。
► 分子标记技术是建立于DNA水平的标记技术，可为
农业研究中的性状选择、品种改良、资源分析、种 及种源的鉴别提供稳定、准确的分子标记。可克服 形态、生化、细胞等遗传标记作为辅助选择和鉴定 中遇到的许多难以解决的疑难。目前，DNA分子标 记技术已广泛地用于生物多样性的分析、种质资源 的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、 作物品种及纯度的鉴定和杂交育种等许多方面，并 显示了独到的优势。分子标记虽处于起步阶段，存 在一定的局限性，但其准确、可靠、高效率等优越 性在实践中已充分表现出来，展现出巨大的应用潜 力和前景。
► 前三种标记都是基因表达的结果，是对基因
的间接反映，标记数目有限，多态性较差， 易受环境的影响，不能满足种质资源鉴定和 育种工作的进行。而DNA分子标记是直接在 DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平 遗传变异的直接反映，它具有不受生育期、 环境和基因表达与否的限制，数量极多，遍 及整个基因组，多态性高，遗传稳定的特点。
AFLP技术的特点： ► AFLP检测的多态性是酶切位点的变化或是酶 切片段间DNA序列的插入与缺失，本质与 RFLP一致。RFLP要采用Southern杂交方 法识别大小不同的限制性酶切片段，从而揭 示DNA的多态性。而AFLP要比RFLP简单得 多，将RAPD的随机性与专一性引物扩增巧 妙结合，而且可以通过控制引物随机核苷酸 的种类和数目来选择扩增不同的DNA片段和 数目。此外，还可以选用不同的内切酶以达 到选择的目的。
分子标记技术及其在农业上的应用
分子标记技术及其在农业上的应用摘要:分子标记技术随着分子生物学的发展而取得了较快的进展，而且分子标记技术被广泛的用于农业生产。
关键词：分子标记分子生物学农业生产分子标记技术的概念分子标记是以个体间遗传物质内核甘酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记技术的主要特点1、具有高的多态性。
2、共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型。
3、能明确辨别等位基因。
4、遍布整个基因组。
5、除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组。
6、选择中性(即无基因多效性)。
7、检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)。
8、开发成本和使用成本尽量低廉9、在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。
与形态标记、生物化学标记、细胞学标记相比，具有以下优越性1、大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利。
2、基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的。
3、在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析。
4、分子标记揭示来自DNA的变异。
5、表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁。
6、检测手段简单、迅速。
主要分子标记技术的基本原理RFLP标记基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。
通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP 图谱。
它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。
由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
分子标记及应用
应用VNTR技术结核分枝杆菌基因分型
Genetic fingerprinting
分子标记
分子标记
Parents and offspring have similar genetic fingerprints 亲子鉴定
博诚
分子标记
6、短串联重复序列— STR
短串联重复序列(simple tandem repeats,STR) 又称 为简单重复序列（simple sequence repeats,SSR），也 称微卫星标记（microsatellite），是均匀分布于真核生 物基因组中的简单重复序列。其串联重复的核心序列 为1-6bp，最常见是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n。 • 微卫星DNA的高度多态性主要来源于串联数目的 不同。由于重复单位的重复次数在个体间,呈高度变异 性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。
分子标记？
•
分子标记
所谓“标记”，是指“便于识别的标识或 者记号”。分子标记的本质是便于识别的特异 性DNA片段，能够识别生物个体或种群间基因 组中某种差异，直接反映了DNA水平的遗传多 态性。
在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA 都可用于标记分析。现在分子标记技术已有数 十种，应用广泛。
•
博诚
分子标记
1、限制性片段多态性分析—RFLP
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是一种以DNA— DNA杂交为基础的第一代遗传标记。用于分析相 关基因多态性的技术。即用同一种限制性内切酶， 酶切来源于同一物种不同个体的基因组DNA，从 而获得长度各异的DNA片段。
5、数目可变串联重复多态性 —VNTR
分子标记内涵及其应用
一、分子标记内涵及其应用分子标记内涵DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体之间的差异，是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映。
分子标记技术被广泛应用于遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建、QTL定位及克隆、基因差异表达分析、基因定位及克隆、比较基因组学、系统进化研究、转基因植物鉴定及分子标记辅助育种等各个方面，是现代生物技术不可缺少的组成部份。
分子标记应用1 遗传多样性分析限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、简单重复序列(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、序列特异性扩增区域(SCAR)、测定序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)、相关序列扩增多态性(SRAP)等，已广泛应用于种质资源遗传多样性和亲缘关系研究等多种领域。
其中，以RAPD和SSR应用最为广泛。
2种质资源鉴定DNA分子检测技术作为植物新品种DUS快速测试的核心技术，一直被研究人员所重视。
分子标记应用于DUS测试的优越性是显而易见的：如多态性高，较少的标记就可满足鉴定的需要；测试周期短，不受季节的限制，可大大缩短从申请到授权的时间测试，可确保试验的顺利进行和试验结果的准确性。
因此，遗传稳定、灵敏、多态性高的分子标记将会是种质资源鉴定的一个重要技术手段。
3 遗传图谱构建分子遗传图谱是指以遗传标记(已知性状的基因或特定DNA序列间重组频率)为基础的染色体或基因内位点的相对位置的线性排列图。
高密度分子遗传图谱的构建是遗传学、分子生物学研究中的一个重要领域，也是进行基因组测序、图位克隆、寻找与表型性状紧密连锁标记进行分子辅助育种的重要工具和理论依据。
4 QTL定位及克隆目前QTL定位主要只是初级定位，还很少能做到精细定位，但已可以把控制一个复杂性状的多个QTL分解开来，并且确定各QTL在染色体上的大体位置及其效应等，使人们加深对数量性状遗传基础的认识. 随着作物QTL定位研究的深入，特别是更为饱和的遗传图谱的构建以及更为有效的统计分析方法的提出，可以预期，QTL定位研究将可在QTL 精细定位、分子标记辅助QTL选择以及QTL克隆分离等方面分阶段实现目标。
8基因工程分子标记技术及其应用
The specific band in Xianyou 63 amplified with AFLP primer combination E-AAC/M-CAT
123
Complementary pattern amplified with AFLP primer p EcoRI-AAG/MseI-CAA. 1. Female parent Zhenxian 97A 2. Shanyou 63(Hybrid); 3. Male parent Minghui63.
分子标记技术及其应用
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker） 分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题；
–无种属特异性 –适合于自动化分析 –不需制备探针、杂交等程序，成本较低。 –DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组
DNA。
1.2 基于PCR技术的分子标记
RAPD缺点：
–是一种显性标记 –稳定性较差
1.2 基于PCR技术的分子标记
特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP） 或称序标位（Sequence Tagged Sites，STS）包括以下两种：
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
相关序列扩增多态性( sequence related amplified polymorphism, SRAP)
分子标记特点和应用
分子标记技术方法和他们特点1、限制性片段长度多态性标记分析(Re striction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLPRFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生RFLP技术特点：RFLP技术优点：①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。
②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。
③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。
④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。
RFLP技术缺点：①分析所需DNA量较大，分析速度慢。
②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。
③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。
④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。
⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。
但是种以上水平影响很小。
2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）—RAPD以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。
它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
RAPD技术特点：RAPD优点：①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。
②适合于自动化分析。
操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。
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第八章分子标记及其应用第八章分子标记及其应用1) 分子标记的种类与特点1. 遗传标记的种类与特点遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列遗传标记的种类与特点1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;3）多态性高，自然存在，无须专门创造；4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型分三大类:1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragmentlength polymorphism ），限制性片段长度多态性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等第三节分子标记的应用1. RFLP标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
关键因素：限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。
探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。
RFLP标记的优缺点优点：1）共显性；2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座；缺点：1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针；2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。
2. RAPD 标记RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。
1990年提出。
基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitaryprimer （8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。
步骤：退火温度36℃左右，其余同普通PCR。
RAPD 标记的优缺点优点：1）简单快速，模板用量少，无需同位素；2）无需基因组序列信息，引物通用；3）成本低。
缺点：1）显性标记，不能鉴别杂合子与纯合子；2）稳定性和重复性较差；受很多因素影响：退火延伸温度，模板浓度，Mg2+浓度，试剂污染，应舍重复3）序列不同但长度相同的片段共迁移，使多态性检测受限制.只能分开片段长度不同的dna片段，对于长度相同但碱基组成不同的就分不出来3. AFLP标记AFLP (Amplified fragment length polymorphism)：扩增片段长度多态性，1992 年提出，RFLP与PCR相结合的产物。
基本原理: 基因组DNA限制酶切（1种为常见6碱基切点，另1种为4碱基稀有识别位点，常为EcoRI（6）/MseI（4）），酶切后DNA片段连接双链人工接头（14~18bp，核心顺序+限制酶识别序列，随机设计），以接头和相邻的限制酶位点作为引物结合位点，进行双引物PCR扩增，产物用高分辨力测序胶分离。
此多态性主要来自引物3`端选择性核苷酸的变化。
AFLP关键技术：引物的设计与组合。
引物由三部分组成:1) 5`端与人工接头互补;2) 中间部分与限制酶识别位点互补;3) 3`端为1~3个选择性核苷酸。
AFLP 图谱常用2~3个选择性碱基，每个泳道50~100条带AFLP标记的优缺点优点：1）兼具PCR的高效性与RFLP的准确性；2）常扩增50~100条带，多态性高，信息量大；3）通过设计不同接头就可得到不同的引物，无需基因组序列信息。
缺点:1）步骤多，流程长，重复性不够好；2）需放射性同位素或荧光素等标记引物，但目前已发展银染技术；3）显性标记。
4. SSR标记SSR（simple sequence repeat）：简单序列重复，也称微卫星(microsatelite) DNA，真核基因组中普遍存在，随机分布，主要位于非编码区；重复单元2~5 bp，串联重复10~60次，多态性主要来自串联重复次数的不同。
SSR标记的原理: 不同基因型某一特定位点的SSR长度不同, 但其侧翼序列往往是保守的单一序列，据此侧翼序列设计双引物，经PCR 扩增即可得到长度不同的SSR片段，产物经PAGE或高浓度琼脂糖凝胶电泳，即可显示不同基因型在此位点的多态性。
注：一般检测的是单一位点的复等位基因，农作物中多数SSR位点的复等位基因数多达十几甚至几十个，多态性高。
SSR侧翼序列的获得：（作为设计引物的模板）一般程序：1）建立基因组DNA的质粒文库；2）根据预得到的SSR类型设计并合成探针，如预获得(AT)n/(TA)n，则合成(AT)n探针；3）用探针筛库，获得阳性克隆；4）对阳性克隆DNA插入序列进行测序。
SSR标记的优缺点优点：1) 序列短，多数小于200bp，易扩增；2) 有高度多态性，信息量大；3) 共显性。
缺点：须获得侧翼序列设计引物，步骤多、费用高；引物具有物种特异性。
5. SNP标记SNP (single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多态性，指不同基因组DNA中某一特定位置上单个核苷酸的差异，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失等，而且其在群体中出现的频率大于1%（如低于1%，则视为点突变，不可能作为标记）。
SNP的分布与遗传效应1）分布于编码区：即cSNP，功能性变异，可能会影响蛋白产物的氨基酸序列和功能。
2）分布于非编码区：即调节区/基因周边SNPs，可能影响基因的表达水平。
SNP是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，有些疾病和性状与SNP有关，如人镰刀型细胞贫血症。
SNP的检测方法：有近百种，包括杂交法、熔解法、电泳法、酶学法、化学法、物理法、测序法（最直接）以及它们的组合方法，综合利用纳米材料技术、多重PCR技术、各种荧光探针设计技术和各种荧光标记技术等。
DNA芯片技术在高通量检测SNP方面显示出独特的优势，最理想、最具有发展潜力，但仍存在成本高、重复性不够好等问题。
SNP标记的优缺点优点：是覆盖全基因组、标记数量最大，多态性最高的标记，缺点：SNP技术主要建立在基因组测序基础之上，尚难在未测序生物上应用。
6. ISSRISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：区间-简单重复序列。
以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行扩增，而不是扩增SSR本身，反映SSR区间多态性。
ISSR引物设计：简单，无需知道DNA序列，长度16~18bp，由1~4bp组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，用以扩增两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列，只有与锚定碱基互补的位点才被靶定，提高了扩增的转一性。
单引物PCR标记。
7. SCARSCAR（sequence characterized amplification region）：特异序列扩增区域标记。
在对基因组DNA做了RAPD分析后，将目标RAPD片段克隆并进行末端测序；再根据2端序列设计特异引物，即前10个碱基应包括原来的RAPD 引物；用此引物对基因组DNA再扩增，即可将与原来RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。
8. STSSTS（sequence-tagged sites）：序列标签位点/序标位，是对以特异引物序列进行PCR扩增的一类分子标记的总称，用来扩增、分析基因组中特定区域的多态性第三节分子标记的应用1. 分子遗传图谱的构建经典遗传图谱：通过遗传重组分析，将基因或形态、生理和生化等常规标记在染色体上线性排列；标记数量少，图距大，饱和度低，应用价值有限。
分子标记遗传图谱：构建原理同上，利用DNA分子标记作图，高密度图谱。
已构建拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等高密度分子遗传图谱，极大地促进了基因定位与克隆、物理图谱的构建和分子标记辅助选择育种等。
2. 基因定位与克隆2.1 基因定位质量性状基因定位：常用近等基因系(NIL，near isogenic lines )分析法和分离集团混合分析法 (BSA，Bulked segregation anlysis)。
近等基因系：是指两个或多个形态上相似，，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，通过杂交和回交获得。
数量性状基因座（QTL，quantitative trait loci ）定位：实质上是确定数量性状位点基因与分子标记间的连锁关系，QTL作图。
定位方法：1）单一标记定位法（single marker analysis）：利用某个标记与某个QTL的连锁关系，杂交后代出现两者之间的同分离现象，标记的不同基因型在数量性状的分布、均值和方差上存在差异，检验差异确定是否与QTL连锁2）区间定位法（interval mapping ，IM）：利用染色体上一个QTL两侧的一对标记，建立个体数量性状测量值对双侧标记基因型指示变量的线性回归关系，根据回归关系是否显著确定QTL的存在，位置和效应。
通过上述方法，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记，进行快速基因定位。
2. 2基因图位克隆首先鉴定与目的基因紧密连锁的分子标记（通常要求在1cM之内），然后由这些标记去筛选大片段DNA文库(YACs或BACs)，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步查等获得含目的基因的克隆，再辅之以转化和互补测验加以确证。
（见前面第7章内容）图位克隆的基本流程：1）构建遗传图谱：目的基因初步定位→分子标记；2）构建物理图谱：局部区域的精细作图，目的基因精细定位(kb/cM)；3）构建基因组文库：BAC、YAC、Cosmid等；4）染色体步行或登陆：获得候选克隆→ 探针；5）筛选基因文库：获得目的克隆；6）鉴定目的基因。