大肠杆菌电转化

大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法

实验步骤：

1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。

2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。

3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。

4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。

5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。

6、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。

7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。

8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。

9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。

11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。

12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。

转化方法:

1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。

2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。

3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。

4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。

5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。

6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。

7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。

8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。