发酵过程中谷氨酸含量的测定

发酵过程中谷氨酸含量的测定

发酵过程中谷氨酸含量的测定 [适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8学时

一、实验目的

了解华勃氏呼吸仪的使用方法，熟悉用华勃氏呼吸仪测定谷氨酸含量。

二、实验原理

发酵液中谷氨酸含量的测定，普遍使用华勃氏呼吸仪，利用专一性较高的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶，在一定温度(37?)、一定pH值(4.8,5.0)和固定容积下，使L-谷氨酸脱羧生成二氧化碳。通过测量反应系统中气体压力的升高，可计算出反应生成的二氧化碳的体积，然后换算成试样中谷氨酸的含量。

三、仪器设备

华氏呼吸仪，1毫升移液管，检压管，反应瓶。

四、相关知识点

大量形成谷氨酸是生产的目的，目前均采用华勃氏呼吸仪测定法。一般从发酵12小时开始，每隔2-4小时测定一次。

五、实验步骤

(一)检压管及反应瓶的准备

将标定完反应瓶常数的检压管及反应瓶磨砂口上的高真空油脂用毛边纸擦试干净，再用棉花用少量二甲苯擦一次，用自来水清洗净后再用稀洗液浸泡约3小时，用自来水洗净，蒸馏水淋洗2次，去水后低温烘干。在检压管下端按上一干净的短橡皮管，橡皮管末

端用玻璃珠塞住。小心将检压管固定在金属板上，在橡皮管内注入检压液。打开三通活塞，旋动螺旋压板，检压液应能上升到最高刻度处，液柱必须连续，不能有气泡，两边高度应一致。

(二)发酵液的稀释

本法要求试样含谷氨酸0.05,0.15,，否则反应生成二氧化碳太多，压力升高太大以致超过检压管刻度而无法读数。一般发酵终了发酵液含谷氨酸6,8,，故应稀释50倍:吸取发酵液2mL，注入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即可。

(三)加液

分别吸取上述发酵稀释液1mL，pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液0.2mL和蒸馏水

1.0mL，置入反应瓶主室，另吸取0.3mL 2,大肠杆菌谷氨酸脱羧酶液置于反应瓶侧室内，使总体积为2(5mL。主侧二室瓶口均以活塞脂涂沫，旋紧瓶塞，将反应瓶用小弹簧紧固在检压管上，将检压计装在仪器的恒温水浴振荡上

(四)预热

将仪器的电源接通，调节水浴温度为37?，打开三通活塞，旋动螺旋压板，调节液面高度达250mm以上，开启振荡;使在37?水浴中平衡约10分钟。

(五)初读

关闭三通活塞，调节右侧管液面在150mm处，再振荡约5分钟，左侧管液面达到平衡后，记下读数Hl mm。若H1变化较大，则需要重新平衡。

(六)反应

记下H1后，用左手指按紧左侧管口，立即取出检压计迅速将酶液倒入主室内(不要倒入中央小杯里)，稍加摇动后放回水浴中，放开左手指，继续振荡让其反应，20分钟后调节右侧管液面于150mm处，振荡3分钟开始读数，继续振荡3分钟后再读数，直至左侧管液柱不再上升为止。记下反应完的左测管读数H2mm。

(七)空白试验

由于测压结果与环境温度、压力有关，故测定时需同时作一个空白对照。空白对照瓶不将酶液倒入主室反应即可，或者在反应瓶内置入2.5mL蒸馏水代替，同样进行初读和终读，其差值即为空白数H。空白读数之差可为正、负值。

(八)计算

谷氨酸含量(克/100毫升),(H2,H1,H)×K×N×100?1000

式中:K为常数， N 为稀释倍速，H2、H1、H 为检压管

反应后、反应前和空白管的读数

六、实验报告要求

实验报告书写统一格式，实验全部完成后，统一交阅，且要求写实验心得。

七、思考题

影响华氏呼吸仪测定精度的主要因素有哪些,

八、实验成绩评定办法

主要评分点:原理描述、实验流程、数据记录、解决问题的能力、

实验结果、等。平时和实验报告各占1/2。