牛奶中酪蛋白含量的测定

牛奶中酪蛋白的提取及含量测定

一、实验原理

1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）

牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由D・半乳糖分子和D・葡萄糖分子通过P -1,4-糖昔键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。

牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。

2、等电点沉淀法：

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出來。

市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂來增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pl偏离了 4.7,通常偏酸。3、酪蛋白的提纯

根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙瞇洗涤，由于乙瞇很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。

4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm o当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm o在一定范围内，考马斯亮蓝G520- 蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。

二、实验器材与试剂

1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管四、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL ft筒、电子分析天平

2、试剂：鲜牛奶、pH4.7醋酸■醋酸钠缓冲溶液、乙醇■乙艇混合液（95%乙醇、无水乙瞇体积比1： 1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液

三、实验操作记录

1、酪蛋白的制备

将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40*C,在搅拌下慢慢加入预热至40・C、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mLo用冰醋酸调节溶液pH至4.7,此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心Smin (4000r/min),弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。

用蒸饰水洗涤沉淀3次(每次约20mL),离心5min (3000r/min),弃去上清液。在沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移到布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醯混合溶液洗涤沉淀2次，最后用乙醯洗涤沉淀2次，捕干。将沉淀摊开在培养皿中，风干，保存至下周。

2、标准曲线的制作

取7支干净干燥试管，按下表进行编号并加入试剂。

混匀，室温静置3min,以第一管为空白，于波长595nm处比色，读収吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横坐标得标准曲线。

表1标准曲线的制作

3

准确称取25mg自制酪蛋白，置于50mL烧杯中,加入约20mL0.9%NaCh再准确加入Imol/LNaOH 5mL,当酪蛋白溶解后,准确加入lmol/L乙酸5mL,充分振摇直至酪蛋白完全溶解为止(不溶可在50°C水浴加热至溶)，全部转移至50mL 容最瓶中，加0.9%NaCI稀释定容至50mL,充分摇匀。取5mL上述蛋白液，转移至另一个50mL容量瓶中，用0.9%NaCI稀释定容至50mLo

另取一支干净试管，加入样品液l.OmL及考马斯亮蓝染液4.0mL,混匀，室温静置3min,于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

四、实验结果

2

由散点图可以看出，后两个点与前面几个点的线性关系并不好，出现了明显 的负偏差。故在线性拟合时舍去后两个点，取前5个点进行拟合。拟合出的直线 R”达到0.983,线性较好。

2、样品液的吸光度是0.324,对照标准曲线得酪蛋白浓度为28.40yg/mLo

称取的酪蛋白样品质最为0.0267g,稀释倍数为500倍。

五、误差分析与讨论

1、 本次制备实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下： 1） 得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中

含有脂质。

2） 考马斯亮蓝G520染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝■蛋白质复合物溶液的

3（酪蛋白）=

能蛋白浓度

xlXhnLxSOO

样品质虽 X 100%= 28.40x10一

6x1x500

0.0267

X 100%=53.2%

|

蛋白质浓度（pg/mL ）

吸光度。

3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管屮加入溶液时挂在管壁，且最终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。

2、注意事项

1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证冬管浓度。并且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。

2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体枳要准确移取，特别是量较少的标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差

3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。