绿豆凝集素提取工艺研究_乃日斯克(1)

羧 甲 基 纤 维 素 离 子 交 换 填 料 （ＣＭ－ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）： Ｗｈａｔｍａｎ 公司； Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ 凝 胶 ： Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公 司； 实验中其他试剂均为分析纯级（ＡＲ）。 １．２ 实验方法 １．２．１ 硫酸铵沉淀 称取 ４０ｇ 绿豆（颗粒饱满， 无病虫 害侵蚀）， 浸泡在蒸馏水中， ２５℃恒温下静置 １２ｈ。浸 泡 好 的 绿 豆 在 ２００ｍＬ ＰＢＳ 缓 冲 溶 液 （０．０５ｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ７．０， 含 ０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、 ０．０３ｍｏｌ／Ｌ β－ 巯 基 乙 醇 、 ５ｇ／Ｌ 聚乙烯吡咯烷酮）中充分捣碎， 静止 １ｈ， 使绿豆 中的淀粉等不溶性杂质沉淀。取上清液， 过 ４ 层纱布 过滤， １２０００ｒ／ｍｉｎ 高速冷冻离心 ２０ｍｉｎ， 收集上清液。 取 ４０ｍＬ 离心后的上清液， 在冰浴条件下（０￣４℃）， 往 收 集 的 上 清 液 中 加 入 固 体 硫 酸 铵 ， 依 次 调 至 ３０％ 、 ４０％、５０％、６０％和 ７０％。 每 一 次 添 加 完 硫 酸 铵 后 ， 再 持 续 搅 拌 ２０ｍｉｎ， １２０００ｒ／ｍｉｎ 冷 冻 离 心 １５ｍｉｎ。 离 心获得的沉淀用 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＰＢ 缓冲溶液充分溶解后， 分别用 ０．９％ ＮａＣｌ 溶液、０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＰＢ（ｐＨ７．０）缓冲 溶 液透析过夜， 期间换 ３ 次透析溶液。 １．２．２ 缓冲溶液的配制 在单因素实验中， 分别选择 β－ 巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和蔗糖。其中 β－ 巯 基乙醇采用 ２５、３０、４０、５５、７０、８０ｍｍｏｌ／Ｌ 等 ６ 个浓 度水平， 聚乙烯吡咯烷酮采用 ５、１０、１５、２５ｇ／Ｌ 等 ４
行了梯度洗脱和间歇式洗脱。
关键词： 绿豆； 凝集素； 酶保护剂
中图分类号： ＴＳ ２０２．３
文献标志码： Ａ
文章编号： １００５－ ９９８９（２００７）０９－ ００７２－ ０４
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒｃｈ ｏｎ ｅ ｘｔｒａ ｃｔｉｏｎ ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｍｕｎｇ ｂｅ ａ ｎ ｌｅ ｃｔｉｎ
０ ￣５０％ ｓ ａｔｕｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ． Ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓ ｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ， ｔｈｅ β－ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ， ｓ ｕｃｒｏｓ ｅ， ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ａｎｄ ｇａｌａｃｔｏｓ ｅ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓ ｕｇｇｅｓ ｔｓ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓ ｅ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ， ｏｎｌｙ β－ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ｈａｓ
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工艺技术
总 活 力／ＨＵ
单 位 活 力／（ＨＵ／２５μＬ）
５
总活力
３０００
４
单位活力 ２５００
２０００ ３
１５００
２
１ ０００
１
５００
０
０
０
１
２
３
４
５
分级沉淀部分 注 ： 横 坐 标 上 １ 、 ２ 、 ３ 、 ４ 、 ５ 分 别 表 示 ０￣３０％ 、 ３０％￣４０％ 、 ４０％￣５０％ 、 ５０％￣６０％ 和 ６０％￣７０％ 饱 和 度 范 围 。
了提高绿豆凝集素的 提 取 率 ， 在 磨 浆 缓 冲 溶 液 中 分 别 加 入 了 β－ 巯 基 乙 醇 、蔗 糖 、聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮
（ＰＶＰ）和半乳糖为保护剂。结果发现， 只有 β－ 巯基乙醇能够明显地提高凝集素的提取率， 蔗糖对凝聚
素没有明显的保护作用； 硫酸铵沉淀后采用羧甲基纤维素（Ｃａｒｂｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）阳离子交换分别进
豆科类凝集素的多种功能在制药、生物定位治 疗癌症等方面已经显现出了极大的前景。绿豆凝集 素是豆科植物凝集素的一种， 也是绿豆活性蛋白质 的一种。绿豆凝集素除了具有豆科植物凝集素普遍 的性质之外， 还具有 α－ 半乳糖苷酶的活性， 这种特 性在凝集素中比较少见。目前为止， 绿豆凝集素的 应 用 研 究 还 没 有 深 入 。Ｊｕｎｅ Ｋ．Ｈ．和 Ａｎ Ｍ．Ｇ．（１９９９）研 究了绿豆凝集素对人外周血细胞因子基因表达的研 究［９］。Ｐｒａｋａｓｈ Ｍ．Ｄ．根据 绿 豆 凝 集 素 的 α－ 半 乳 糖 苷 酶 特 性 研 究 了 血 型 转 换 的 可 能 性［１０］。
本文中着重探讨了凝集素的提取工艺， 并比较 了羧甲基纤维素阳离子交换层析的梯度洗脱法和间 歇式洗脱法。
１ 实验材料与方法
１．１ 实验材料 绿豆（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）： 大明绿豆， 产 地 为 内 蒙 古 ；
兔血从成年健康大白兔（新西兰大耳兔， 清洁级， ＣＬ， ＧＢ／Ｔ １４９２６．６４－ ２００１）耳缘静脉取得。
收稿日期： ２００７－ ０４－ ０６
＊ 通讯作者
基金项目： 国家“十一五”课题。
作者简介： 乃日斯克（１９８３－ ）， 内蒙古呼和浩特人， 硕士研究生， 研究方向为绿豆凝集素的纯化与性质研究。
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工艺技术
绿豆中含有多种活性蛋白质。目前已经分离出 来的绿豆活性蛋白有耐热二铵类氧化酶［２］， 具有抗真 菌 效 果 的 几 丁 质 酶［３］， 具 有 抗 真 菌 和 抗 细 菌 效 果 的 ｎｓＬＴＰ 蛋白［４］， ａｌｐｈａ 半乳糖苷酶异构体［５］， 乙酰酯酶［６］， 胰蛋白酶抑制剂［７］， ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ 蛋白（抗植物致 病 菌 因 子）［８］等 等 。
绿豆（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）， 又名青小豆， 为豆科草本植物 绿豆（Ｖｉｇａ ｒａｄｉａｔａ）的成熟种子， 作为粮食作物在我国各 地都有种植。绿豆中蛋白质 含 量 高 达 １９．５％￣３３．１％， 包括球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白， 其中 以球蛋白和清蛋白为主， 这两种蛋白质是绿豆种子 的主要贮藏蛋白质。氨基酸组成分析表明： 其氨基 酸组成中， 球蛋白氨基酸富含赖氨酸， 缺乏含硫氨
个 浓 度 水 平 ， 蔗 糖 采 用 ０．１、０．３、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ 等 ３ 个 浓 度 水 平 ， Ｄ－ 半 乳 糖 采 用 １、２、３、４、５ｍｍｏｌ／Ｌ 等 ５ 个 浓 度 水 平 ， 分 别 溶 解 于 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）缓 冲溶液中， 用于磨浆。 １．２．３ 羧 甲 基 纤 维 素（ＣＭ－ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）阳 离 子 交 换 层 析 用 充 分 溶 胀 的 羧 甲 基 纤 维 素 填 料 填 １×４０ｃｍ 层 析 柱 ， 并用 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）磷酸盐缓冲溶液（ＰＢ）充分平衡。 将 硫 酸 铵 沉 淀 之 后 的 样 品 稀 释 ２ 倍 ， 取 ２ｍＬ 上 柱 。 在ＮａＣｌ 梯 度 洗 脱 实 验 中 ， 先 用 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ＝７．０）磷 酸盐缓冲溶液洗脱离子交换柱， 洗出杂蛋白， 随后用 ０￣０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 梯 度 洗 脱 。 洗 脱 速 度 为 １．０ｍＬ／ｍｉｎ。 ５ｍｉｎ 收 集 一 管 。 在 间 歇 式 洗 脱 实 验 中 ， 分 别 用 １００ｍＬ ０．１、０．２、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶液依次洗脱， 每用 一个 ＮａＣｌ 梯度洗脱从蛋白峰开始出现连续洗脱 ， 直 至无蛋白峰出现为止。 １．２．４ 血液抗凝剂的配制 称取 ５ｇ 柠檬酸三钠， 加 入 １００ｍＬ ０．９％ 生理盐水， 充分溶解后， １２１℃ ２０ｍｉｎ 灭菌， 放置在 ４℃冰箱内， 备用。 １．２．５ ２％兔血红细胞的配制 用 ２ｍＬ 注射器， 从成 年 实 验 白 兔 耳 缘 静 脉 抽 取 大 约 ０．５ｍＬ 血 液 ， 立 刻 放 入抗凝剂内， 轻轻倒置混合后， 在 ３０００ｒ／ｍｉｎ 下冷冻 离 心 ５ ｍｉｎ。 离 心 后 将 上 清 液 弃 去 ， 加 入 ４ｍＬ ０．９％ 生理盐水， 充分混合， 洗去残留的抗凝剂， 离心去上 清液。如此 操 作 ３￣４ 遍 ， 直 至 上 清 液 变 为 无 色 。用 移液枪抽取红色沉淀， 按照 ２％（ｖ／ｖ）加入 ０．９％ 生理盐 水， 充分混合后， 放置在 ４ ℃冰箱内， 备用。 １．２．６ 凝集素活力的测定 取 ９６ 孔微型凝血 板 ， 在 每一个孔内滴入 ２５μＬ ０．９％生理盐水。取 ２５μＬ 硫酸 铵沉淀样品， 进行系列倍比稀释（从前一孔吸取 ２５μＬ 液体， 放入下一孔内， 充分混合后 ２５μＬ 液体放入下 一孔内， 如此 操作至倒数第 二 个 孔）， 留 下 每 一 排 的 最 后 一 空 ， 作 为 对 照 。 在 每 一 个 孔 内 滴 入 ２５μＬ ２％ 兔血红细胞， 室温下放置 ３０ｍｉｎ 后观察。 １．２．７ 蛋 白 质 含 量 测 定 蛋 白 质 的 测 定 采 用 双 缩 脲 法 ［ １１ ］ 。 １．２．８ 数 据 处 理 离 子 交 换 层 析 的 图 片 采 用 Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ 生成。
ｓ ｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｌｅｃｔｉｎ． Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ５ｇ／Ｌ， ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓ ｅｎｅｓ ｓ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓ ｔ． Ｃａｒｂｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓ ｅ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｕｓ ｅｄ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｌｅｃｔｉｎ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓ ｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｂａｔｃｈ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｔｈａｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ； ｌｅｃｔｉｎ； ｅｎｚｙｍｅ ｓ ｔａｂｉｌｉｚｅｒ
工艺技术
绿豆凝集素提取工艺研究
乃日斯克， 郇美丽， 沈 群 ＊ （中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 １０００８３）