常用接种技术及培养_图文.ppt
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微生物的接种与培养
微生物的培养方法实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。
一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种.１、接种工具和方法在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种.在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图1)图1 接种和分离工具1．接种针 2。
接种环 3。
接种钩 4。
5。
玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8。
小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２)三点接种在研究霉菌形态时常用此法.此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基.它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基,迅速轻轻摇匀,这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板,让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
新生儿首针乙肝疫苗和卡介苗接种技术培训PPT精选课件
20
21
3.抽取苗液
22
23
排气
空气 苗液
排气 至锁 定刻 度
抽苗液前 抽吸苗液
指弹气泡 气泡上移
下拉芯杆，使气 泡与外空气相通
24
四、接种门诊具备的条件
－接种人员配备
执业医师、执业助理医师、护士或乡村 医生资格，经县疾控中心培训考核合格
熟悉业务知识，有应急处理能力，相对 稳定
接种人员数配置，与辖区服务人口数量、 服务周期适应
剂量和用法： 0.1ml/人（1人份）。5人次用剂量BCG
加入 0.5ml所附稀释液，摇匀使之完全溶解成均匀悬液。 疫苗打开溶解后30分钟内用完。 用1ml蓝芯注射器
免疫程序： 接种1剂次。
8
卡介苗的使用
储存温度：2-8℃避光保存和运输，严禁冻结。 注射部位：左上臂三角肌外下缘皮内。 操作方法： 家长抱紧儿童，露出儿童胳膊； 用1ml一次性注射器或一次性蓝芯注射器配4.5号 针头吸取1人份疫苗，皮肤常规消毒，待酒精干后， 左手绷紧注射部位皮肤，右手持注射器，食指固 定针管，针头斜面向上，与皮肤呈10～15角刺入 皮内。
32
谢谢
严禁接种皮下和肌肉 10
接种实施--接种技术操作要点
皮 内 注 射 法
11
卡介苗的使用
禁忌症
1、患急性或慢性严重疾病者、慢性疾病的急性发作期和发热者。 2、免疫缺陷、免疫功能低下或正在接受免疫抑制剂治疗者发热者暂缓接种。 3、对疫苗已知的任何成分过敏者。 4、患脑病、未控制的癫痫和其他进行神经系统疾病者。 5、早产、体重<2500g、难产或有先天性畸形的新生儿。 6、患湿疹或其他皮肤病患者。 注意事项
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接种门诊具备的条件
21
3.抽取苗液
22
23
排气
空气 苗液
排气 至锁 定刻 度
抽苗液前 抽吸苗液
指弹气泡 气泡上移
下拉芯杆，使气 泡与外空气相通
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四、接种门诊具备的条件
－接种人员配备
执业医师、执业助理医师、护士或乡村 医生资格，经县疾控中心培训考核合格
熟悉业务知识，有应急处理能力，相对 稳定
接种人员数配置，与辖区服务人口数量、 服务周期适应
剂量和用法： 0.1ml/人（1人份）。5人次用剂量BCG
加入 0.5ml所附稀释液，摇匀使之完全溶解成均匀悬液。 疫苗打开溶解后30分钟内用完。 用1ml蓝芯注射器
免疫程序： 接种1剂次。
8
卡介苗的使用
储存温度：2-8℃避光保存和运输，严禁冻结。 注射部位：左上臂三角肌外下缘皮内。 操作方法： 家长抱紧儿童，露出儿童胳膊； 用1ml一次性注射器或一次性蓝芯注射器配4.5号 针头吸取1人份疫苗，皮肤常规消毒，待酒精干后， 左手绷紧注射部位皮肤，右手持注射器，食指固 定针管，针头斜面向上，与皮肤呈10～15角刺入 皮内。
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谢谢
严禁接种皮下和肌肉 10
接种实施--接种技术操作要点
皮 内 注 射 法
11
卡介苗的使用
禁忌症
1、患急性或慢性严重疾病者、慢性疾病的急性发作期和发热者。 2、免疫缺陷、免疫功能低下或正在接受免疫抑制剂治疗者发热者暂缓接种。 3、对疫苗已知的任何成分过敏者。 4、患脑病、未控制的癫痫和其他进行神经系统疾病者。 5、早产、体重<2500g、难产或有先天性畸形的新生儿。 6、患湿疹或其他皮肤病患者。 注意事项
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接种门诊具备的条件
细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术ppt课件
20
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
21
实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
22
c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
18
实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
19
第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。
目的要求
掌握从环境中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术。
21
实验材料
无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2
支、10mL1支。
营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
22
c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放 在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
18
实验程序4
（培养基和玻璃器材的灭菌方法）
过滤除菌法： 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清），一般 可用细菌过滤器进 行除菌。
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第二部分 细菌纯种分离、培养和接
种技术
目的要求 实验材料 实验程序
9
实 验 程 序2
（培养基的配制方法和步骤） 3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.6，用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
实验二
细菌培养基的配制、灭 菌及接种、培养技术
1
第一部分 细菌培养基的制备、灭菌
目的要求 实验材料 实验程序
2
目的要求
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。
3
实验材料
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。
高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
微生物的无菌操作及接种技术ppt课件
精品
25
※ 斜面接种
（6）接种:
在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从 斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培 养基。
有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作 斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
精品
26
※ 斜面接种
(7) 塞管塞： 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞 旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁 空气。
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
分区划线法
精品
32
2、常用的接种方法
※划线接种
连续划线法
精品
33
2、常用的接种方法
※穿刺接种
用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的 深层培养基中的接种方法。 • 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。 • 只适宜于细菌和酵母的接种培养
工作台等
精品
14
进入无菌室前的准备
（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定； （2）用紫外线灭菌处理30~60min； （3）检查无菌器材是否完备； （4）实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒
精棉球将手擦干净。 （5）缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、
鞋。
精品
15
无菌操作要求
动态。
精品
10
无菌环境的要求与保持
2、超净工作台
超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以 保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程 度的保护以防污染并保护操作者。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空 气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分， 现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。
第四章外植体的接种与培养ppt课件
2019/12/30
震荡培养
往复式摇床
自旋式培养架
2019/12/
第三节 培养条件
• 一．温度 • 二．光照 • 三．培养基的pH • 四．湿度 • 五．氧和其它气体
2019/12/30
一．温度
• 一般温度在25±2℃。通常低于15℃时， 外植体生长出现停滞，但高于35℃对生 长又不利。在促进芽发生时温度可略低 一些。
• 有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形 成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分 化率。
• 一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少 的光。
2019/12/30
2.光质
• 光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组 织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的 生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。 在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周 后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗， 11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝 光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见 愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化 。
• 培养过程中，培养物释放的微量的乙烯 和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养 物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害 培养物。
2019/12/30
第四节 外植体褐变及防止
• 在组织培养中，常见到外植体由于褐变 （browning），产生致死性的褐化物， 不仅使培养基变褐，而且造成培养失败 ，它已经成为组织培养中的一个棘手问 题，同时也成为植物快繁体系建立的一 大障碍。可以说褐变、菌类污染、和过 度含水（玻璃化）是组织培养中的三大 难题，尤其是褐变。
2019/12/30
蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象
2019/12/30
一．褐变的原因
• 很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类 化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物 与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切 割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破 ，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化 酶便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和 水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外 植体的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡 。
震荡培养
往复式摇床
自旋式培养架
2019/12/
第三节 培养条件
• 一．温度 • 二．光照 • 三．培养基的pH • 四．湿度 • 五．氧和其它气体
2019/12/30
一．温度
• 一般温度在25±2℃。通常低于15℃时， 外植体生长出现停滞，但高于35℃对生 长又不利。在促进芽发生时温度可略低 一些。
• 有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形 成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分 化率。
• 一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少 的光。
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2.光质
• 光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组 织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的 生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。 在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下8周 后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗， 11周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝 光下12周后才出现愈伤组织；白光下则为未见 愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化 。
• 培养过程中，培养物释放的微量的乙烯 和高浓度的二氧化碳有时会有利于培养 物的生长，但更多的是阻碍甚至是毒害 培养物。
2019/12/30
第四节 外植体褐变及防止
• 在组织培养中，常见到外植体由于褐变 （browning），产生致死性的褐化物， 不仅使培养基变褐，而且造成培养失败 ，它已经成为组织培养中的一个棘手问 题，同时也成为植物快繁体系建立的一 大障碍。可以说褐变、菌类污染、和过 度含水（玻璃化）是组织培养中的三大 难题，尤其是褐变。
2019/12/30
蝴蝶兰试管苗增殖过程中的褐化现象
2019/12/30
一．褐变的原因
• 很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类 化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物 与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切 割外植体后，切割附近细胞的分隔效应被打破 ，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化 酶便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和 水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外 植体的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡 。
工业微生物接种技术ppt课件
工业微生物的培养方法
微生物培养技术的发展特点： ① 从少量培养→大规模培养 ② 从浅层培养→厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养 ③ 从固体培养→液体培养 ④ 从静止式液体培养→通气搅拌式的液体培养 ⑤ 从单批培养→连续培养→多级连续培养 ⑥ 从分散的微生物细胞→固定化的细胞集团
⑦ 从微生物细胞→动、植物细胞大规模培养； ⑧ 从野生型菌种→突变株、遗传工程菌株； ⑨ 从单菌发酵→多菌发酵； ⑩ 从低密度培养→高密度培养； ⑪ 从人工控制的发酵罐→到多传感器、计算机在线控制的自动 化发酵罐等。
无菌环境的要求与保持
无菌室 无菌环境 超净工作台
无菌环境的要求与保持
1、无菌室 （1）无菌室的结构： • 密封、避光，设百叶通气窗，侧面底部设进气孔
• 应有缓冲间(外间)、操作间
• 安装拉门
（2）无菌室内的设备
• 缓冲间、操作间安装日光灯和紫外灯，紫外灯 距地高度2.0-2.2m; • 缓冲间内放置工作服、鞋、帽、口罩，消毒用 药物； • 超净工作台，内备接种用常用器具;酒精灯、 接种环、打火机或火柴、记号笔、镊子、酒精 棉球瓶
（3）无菌室的消毒和防污染
• 无菌室内空气测试应基本达到无菌。
• 使用前后紫外线照射均照射30min
• 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时） • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
（4）无菌室空气污染情况的检验
使用前或操作后检查，应无杂菌； 若杂菌多为霉菌时，应通风干燥；杂菌多为细菌 时，乳酸熏蒸效果较好。
工业微生物接 种技术
无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防 止各类微生物污染及其干扰的一系列操作方法和有 关措施。
一、防污染措施
物品：高压湿热灭菌 污染 途径 操作者：无菌工作服、鞋、帽、口罩 环境
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