微生物的分离纯化与接种技术精品PPT课件
合集下载
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
第三周微生物分离纯化接种与培养技术PPT课件
液体培养基分离纯培养 同一稀释度做多个平行管，95%表现为不生长 。
第3页/共17页
二、微生物纯培养技术
稀释平板分离法使用过程中的几个问题 1) 梯度稀释度的确定： 需分离微生物在样品中的数量 2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征 3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性 4) 操作要点： 无菌操作
基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方 法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分
离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金
霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。
• tupian
第12页/共17页
（二）划线分离纯化
• 1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。 • 2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4
天。 • 划线方法如图：
2 1
3 4
第13页/共17页
（三）纯化、镜检，得到纯种培养
• 1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4 天。
选择培养分离
1、利用选择培养基进行直接分离。 2、富集培养（多次培养后再分离）
二元培养物：培养物中/共17页
•
为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微
生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养
第10页/共17页
三、材料与仪器
•1、培养基：阿斯毕无氮 培养基。 •2、菜园土。 •3、灭菌培养皿、镊子、 剪刀、接种针、酒精灯
第11页/共17页
第3页/共17页
二、微生物纯培养技术
稀释平板分离法使用过程中的几个问题 1) 梯度稀释度的确定： 需分离微生物在样品中的数量 2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征 3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性 4) 操作要点： 无菌操作
基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方 法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分
离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金
霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。
• tupian
第12页/共17页
（二）划线分离纯化
• 1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。 • 2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4
天。 • 划线方法如图：
2 1
3 4
第13页/共17页
（三）纯化、镜检，得到纯种培养
• 1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4 天。
选择培养分离
1、利用选择培养基进行直接分离。 2、富集培养（多次培养后再分离）
二元培养物：培养物中/共17页
•
为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微
生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养
第10页/共17页
三、材料与仪器
•1、培养基：阿斯毕无氮 培养基。 •2、菜园土。 •3、灭菌培养皿、镊子、 剪刀、接种针、酒精灯
第11页/共17页
微生物的分离和纯培养 PPT课件(共4个) 中图版
微生物的分离和纯培养
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。
2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。
3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
•
27、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。励志名言：比别人多一点执着，你就会创造奇迹
•
28、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。
•
29、人生就像一道漫长的阶梯，任何人也无法逆向而行，只能在急促而繁忙的进程中，偶尔转过头来，回望自己留下的蹒跚脚印。
•
17、一个人只要强烈地坚持不懈地追求，他就能达到目的。你在希望中享受到的乐趣，比将来实际享受的乐趣要大得多。
•
18、无论是对事还是对人，我们只需要做好自己的本分，不与过多人建立亲密的关系，也不要因为关系亲密便掏心掏肺，切莫交浅言深，应适可而止。
•
19、大家常说一句话，认真你就输了，可是不认真的话，这辈子你就废了，自己的人生都不认真面对的话，那谁要认真对待你。
•
15、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。
• 1 土壤样品 • 2 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基 （2）高氏1号培养基 （பைடு நூலகம்）马铃薯培养基（PDA培养基）
实验方法与步骤
• 1.平板的制作： 将已灭菌的培养基融化，冷却到40-50℃， 倒平板。
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。
2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。
3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
•
27、我们无法选择自己的出身，可是我们的未来是自己去改变的。励志名言：比别人多一点执着，你就会创造奇迹
•
28、伟人之所以伟大，是因为他与别人共处逆境时，别人失去了信心，他却下决心实现自己的目标。
•
29、人生就像一道漫长的阶梯，任何人也无法逆向而行，只能在急促而繁忙的进程中，偶尔转过头来，回望自己留下的蹒跚脚印。
•
17、一个人只要强烈地坚持不懈地追求，他就能达到目的。你在希望中享受到的乐趣，比将来实际享受的乐趣要大得多。
•
18、无论是对事还是对人，我们只需要做好自己的本分，不与过多人建立亲密的关系，也不要因为关系亲密便掏心掏肺，切莫交浅言深，应适可而止。
•
19、大家常说一句话，认真你就输了，可是不认真的话，这辈子你就废了，自己的人生都不认真面对的话，那谁要认真对待你。
•
15、所有的辉煌和伟大，一定伴随着挫折和跌倒；所有的风光背后，一定都是一串串揉和着泪水和汗水的脚印。
• 1 土壤样品 • 2 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基 （2）高氏1号培养基 （பைடு நூலகம்）马铃薯培养基（PDA培养基）
实验方法与步骤
• 1.平板的制作： 将已灭菌的培养基融化，冷却到40-50℃， 倒平板。
微生物的分离和纯培养ppt(共4个)精品课件
平均菌落数×稀释倍数 微生物的细胞个数（个/g）＝ 土壤克数
微生物分离基本方法及原则
分离微生物时一般是根据该微生物对营养， pH，氧气，温度等要求的不同，供给它们合 适的条件或加入某种抑制剂，形成只利于该菌 种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘 汰不需要的菌种。
(1)分离细菌：取10-7、10-8两个稀释度各0.2ml加入 培养皿中，涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培 养，24小时。 (2) (2) 分离霉菌：取10-5、10-6两个稀释度各0.2ml，涂 布土豆平板（倒平板前在土豆培养基中加入80% 的乳酸5滴），28℃倒置培养，3～4天。 (3) 分离放线菌：取10-5、10-6两个稀释度各0.2ml， （制备菌悬液时，应先加入10%酚10滴）涂布淀 粉平板，28℃倒置培养，7～10天。
大肠杆菌菌落
伊红美蓝培养基
曲霉
酵母菌落
霉菌菌落 青霉
放线菌菌落
A：诺尔斯氏链霉菌 B：皮疽诺卡氏菌 C：酒红指孢囊菌 D：游动放线菌 E：小单胞菌 F：马杜拉放线菌
产抗菌素的放线菌
A：卡特利链霉菌 B：弗氏链霉菌 C：吸水链霉菌金泪亚种 D：卡那霉素链霉菌 E：除虫链霉菌 F：生磺酸链霉菌
实验材料
微生物的分离和纯培养
（实验11）
• 目的要求
1．学会将混杂的微生物分离成纯种，掌握 统计分析样品中微生物的种类和数量的 方法。 2．学会从菌落及培养形态特征区分细菌、 放线菌和霉菌。 3．掌握几种纯化微生物的基本操作技术 （制作平板、连续稀释、平板划线）
实验原理
• 自然界中不同种类的微生物混杂生活在一起， 要研究某种微生物的特性，必须从混杂的微生 物类群中分离它，使该微生物处于纯培养状态 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯 化。
微生物的分离纯化和培养技术124页PPT
查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋 白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。
2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中， 在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水 的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然 后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的 试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得 只含某一种或某一株微生物的过程。
为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落 并不一定保证是一种菌。
常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法
吉林大学生物基础实验教学中心
一. 目的要求 二. 实验原理 三. 微生物培养技术 四. 结果观察
（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 （5）将试管口在火焰上微烧一周。 （6）参照图（7-1） （7）将接种环抽出，灼烧管口。 （8）塞上棉塞。 （9）将接种环经火焰灼烧灭菌。
吉林大学生物基础实验教学中心
将已接种的斜面、半固体和液体 培养基放置培养箱中培养将生长好的 菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保 存。
接种
吉林大学生物基础实验教学中心
培养
吉林大学生物基础实验教学中心
微生物的纯化培养
吉林大学生物基础实验教学中心
吉林大学生物基础实验教学中心
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实 验日期。 2、划线方法
稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
吉林大学生物基础实验教学中心
2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中， 在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水 的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然 后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的 试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
微生物的分离、纯化及培养技术
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得 只含某一种或某一株微生物的过程。
为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落 并不一定保证是一种菌。
常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法
吉林大学生物基础实验教学中心
一. 目的要求 二. 实验原理 三. 微生物培养技术 四. 结果观察
（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 （5）将试管口在火焰上微烧一周。 （6）参照图（7-1） （7）将接种环抽出，灼烧管口。 （8）塞上棉塞。 （9）将接种环经火焰灼烧灭菌。
吉林大学生物基础实验教学中心
将已接种的斜面、半固体和液体 培养基放置培养箱中培养将生长好的 菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保 存。
接种
吉林大学生物基础实验教学中心
培养
吉林大学生物基础实验教学中心
微生物的纯化培养
吉林大学生物基础实验教学中心
吉林大学生物基础实验教学中心
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实 验日期。 2、划线方法
稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
吉林大学生物基础实验教学中心
实验二微生物的分离纯化ppt课件
鉴别肠道细菌 鉴别水中大肠菌群 鉴别水中大肠菌群
液体培养基分离纯培养
工
稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的
业
微 生
许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表
物 与
现为不生长。
育
种 学
单细胞（孢子）分离
实
验
——
一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操
宜
宾 作难度与细胞或个体的大小成反比；
学
院
（3）形态观察
与 育
面划线接种
种 学
• 浅盘固体接种
实
验
——
宜 宾 学 院
无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行
工 业 微 生 物 与 育 种 学 实 验
宜 宾 学 院
——
工 业 微 生 物 与 育 种 学 实 验
宜 宾 学 院
——
工
业
划线分离
微
生
物
与
育
种
学
实
验
——
宜 宾 学 院
工 业 微 生 物 与 育 种 学 实 验
各大类
3~6月 简便
细菌、酵母菌 6~12月 简便
各大类** 1~2年 简便
产孢子微生物 1~10年 简便 有效
各大类
5~15年 简便 以上 有效
微
生
工
物
业 微
学
生 物 与
实 验
育 种
室
学
的
实 验
常
——
规
宜 宾
操
学 院
作
程
序
培养基特征性变化 蛋白水解圈 明胶液化 由淡红色变成深红色
主要用途 鉴别产蛋白酶菌株 鉴别产蛋白酶菌株 鉴别产脂肪酶菌株
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4 三个稀释度的菌液各1mL，加入相应编号的 空平板中。 （5）取保温于45℃水浴中的营养琼脂培养基 倒入上述平板中，每板倒入15～20mL培养基， 立即平面旋摇使菌液与培养基充分混匀，盖上 平板盖子。 （6）等培养基凝固后将平板倒置于37℃培养 箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三 个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营 养琼脂平板中。（注意移液管不能混用）
（5）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释 度菌液要用不同的涂布棒）
（6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37℃ 培养箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（2）分区划线分离法（每人划1块营养琼脂平板）
a. 灭菌接种环。 b. 冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基
表面a处。 c. 再将接种环灭菌。 d. 冷却后，从a处将菌划出至b处。 e. 接种环再次灭菌。 f. 从b处划出至c处。 g. 再次灭菌接种环。 h. 从c处划出至d处。 i. 将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
• 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株 微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分 离法普遍用于微生物的分离与纯化。
• 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常 是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑 取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀 释平板法、划线分离法等。
三、实验器材及试剂
（2）取4支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编 号10-1，10-2，10-3，10-4，再取3个倒好营养琼脂 培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4 。
四、实验步骤
（3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操 作的方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1 支无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸 取1mL菌液至10-2管中。另取1支无菌移液管 ，在10-2中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至 10-3管中。另取1支无菌移液管，在10-3中吹吸 数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。（注 意移液管不能混用）
四、实验步骤
四、实验步骤
7. 稀释倾注法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）
（1）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶60mL营养 琼脂培养基，将熔化的培养基放于45℃水浴中保温 待用。 （2）取4支装有9mL无菌水的试管，依次编号10-1， 10-2，10-3，10-4 ，再取3个无菌空平板，分别编号 10-2，10-3，10-4 。 （3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的 方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1支无菌移液 管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-2 管中。另取1支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混 匀后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支无菌移液管， 在10-3中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。
• 接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、 涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、生理盐水、大肠杆菌菌液。
四、实验步骤
1. 接种环的使用 • 接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用
前后都要用酒精灯外焰严格灭菌。
接种环的灭菌方法
四、实验步骤
2. 斜面接种（每人接种2支试管斜面，1支斜面 接斜面，1支液体接斜面）
• 将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管 握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养 基管位于下侧，斜面均向上。
• 右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时 夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。
• 在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一 环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上“Z”形 划线。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试 管时不应触及试管口。
• 接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h后观察结
果。
斜面接种示意图
四、实验步骤
3. 液体接种（每人接种2支液体试管，1支斜面 接液体，1支液体接液体）
• 操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免 培养基流出。
• 接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗 下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻 轻敲打，使菌体充分分散。
四、实验步骤
四、实验步骤
5. 琼脂平板划线分离法 • 琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分
离法和分区划线分离法。
（1）连续划线分离法（每人划1块营养琼脂 平板）
a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。 b.在培养基表面连续“之”字形划线，直至划
完整个平板表面。
四、实验步骤
连续划线法
四、实验步骤
实验六 微生物的分离纯化与接种技术
一、实验目的
1.掌握常用接种工具的使用 2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法 3.掌握倒平板技术 4.掌握各种分离单菌落的技术
二、实验原理
• 接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技 术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的 过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接 种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种 不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。
四、实验步骤
分区划线法
灭菌接种环 第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
四、实验步骤
四、实验步骤
6. 稀释涂布法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各涂布1块平板）
（1）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶60 mL营养 琼脂培养基。待培养基冷却到50℃左右（用手抓 瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入 15～20mL培养基（自然铺满整个底面为准）， 等凝固后备用。
• 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h 后观察结果。
四、实验步骤
4. 倒平板（每组倒6或8块营养琼脂平板） （1）熔化培养基：电炉加热熔化120mL（或
160mL）那瓶营养琼脂培养基（电炉加热时 人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。 （2）倒平板：待培养基冷却到50℃左右（用 手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿 倒入15～20mL培养基（自然铺满整个底面 为准），等凝固后备用。
四、实验步骤
（4）用无菌移液管分别吸取10-2，10-3，10-4三 个稀释度的菌液各0.1mL，加入相应编号的营 养琼脂平板中。（注意移液管不能混用）
（5）用无菌涂布棒涂抹均匀。（涂抹不同稀释 度菌液要用不同的涂布棒）
（6）等菌液吸收进培养基后将平板倒置于37℃ 培养箱中培养24h后观察结果。
四、实验步骤
（2）分区划线分离法（每人划1块营养琼脂平板）
a. 灭菌接种环。 b. 冷却后，蘸取少许混匀的菌液，划线于平板培养基
表面a处。 c. 再将接种环灭菌。 d. 冷却后，从a处将菌划出至b处。 e. 接种环再次灭菌。 f. 从b处划出至c处。 g. 再次灭菌接种环。 h. 从c处划出至d处。 i. 将平皿倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
• 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株 微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分 离法普遍用于微生物的分离与纯化。
• 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落通常 是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑 取单菌落而获得一种纯培养。获取单菌落可用稀 释平板法、划线分离法等。
三、实验器材及试剂
（2）取4支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次编 号10-1，10-2，10-3，10-4，再取3个倒好营养琼脂 培养基的平板，分别编号10-2，10-3，10-4 。
四、实验步骤
（3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操 作的方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1 支无菌移液管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸 取1mL菌液至10-2管中。另取1支无菌移液管 ，在10-2中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至 10-3管中。另取1支无菌移液管，在10-3中吹吸 数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。（注 意移液管不能混用）
四、实验步骤
四、实验步骤
7. 稀释倾注法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各加1mL菌液到平板，倾注培养基分离）
（1）熔化培养基。电炉加热熔化另一瓶60mL营养 琼脂培养基，将熔化的培养基放于45℃水浴中保温 待用。 （2）取4支装有9mL无菌水的试管，依次编号10-1， 10-2，10-3，10-4 ，再取3个无菌空平板，分别编号 10-2，10-3，10-4 。 （3）稀释菌液。取1支无菌移液管，按无菌操作的 方法吸取1mL菌液于10-1试管中。另取1支无菌移液 管，在10-1中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-2 管中。另取1支无菌移液管，在10-2中吹吸数次，混 匀后吸取1mL菌液至10-3管中。另取1支无菌移液管， 在10-3中吹吸数次，混匀后吸取1mL菌液至10-4管中。
• 接种环、酒精灯、试管、移液管、培养皿、 涂布棒、营养琼脂培养基、营养肉汤培养 基、生理盐水、大肠杆菌菌液。
四、实验步骤
1. 接种环的使用 • 接种环是用铂丝或细电炉丝制成的，使用
前后都要用酒精灯外焰严格灭菌。
接种环的灭菌方法
四、实验步骤
2. 斜面接种（每人接种2支试管斜面，1支斜面 接斜面，1支液体接斜面）
• 将菌种管（若是液体菌种应先摇匀）与空白斜面培养基管 握在左手大拇指和其他四指之间，菌种管位于上侧，培养 基管位于下侧，斜面均向上。
• 右手持接种环火焰灭菌。以右手掌心、小指和无名指同时 夹取两管口的棉塞，将两试管口迅速通过火焰灭菌。
• 在火焰附近，用灭菌的接种环从菌种管挑取少量菌苔或一 环菌液，伸进待接种的培养基管斜面底部，向上“Z”形 划线。接种时不要划破培养基表面，沾菌的接种环进出试 管时不应触及试管口。
• 接种完后灼烧管口，塞上棉塞。灼烧接种环，放回原处。 • 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h后观察结
果。
斜面接种示意图
四、实验步骤
3. 液体接种（每人接种2支液体试管，1支斜面 接液体，1支液体接液体）
• 操作方法与前相同，但要使试管口向上斜，以免 培养基流出。
• 接入菌体后，使接种环和管内壁摩擦几下以利洗 下环上菌体，接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻 轻敲打，使菌体充分分散。
四、实验步骤
四、实验步骤
5. 琼脂平板划线分离法 • 琼脂平板划线分离的方法一般有连续划线分
离法和分区划线分离法。
（1）连续划线分离法（每人划1块营养琼脂 平板）
a.灭菌接种环，冷却后取适量混匀的菌液。 b.在培养基表面连续“之”字形划线，直至划
完整个平板表面。
四、实验步骤
连续划线法
四、实验步骤
实验六 微生物的分离纯化与接种技术
一、实验目的
1.掌握常用接种工具的使用 2.掌握斜面培养基、液体培养基接种法 3.掌握倒平板技术 4.掌握各种分离单菌落的技术
二、实验原理
• 接种是微生物实验及科研的一项最基本的操作技 术，是将一种微生物移接到灭过菌的新培养基的 过程。接种方法有斜面接种、液体接种、平板接 种、穿刺接种等。在接种过程中，为了确保纯种 不被杂菌污染，必须采用严格的无菌操作。
四、实验步骤
分区划线法
灭菌接种环 第一区划线
灭菌接种环
第二区划线
灭菌接种环
第三区划线
灭菌接种环
四、实验步骤
四、实验步骤
6. 稀释涂布法（每组稀释10-2，10-3，10-4稀释 度菌液各涂布1块平板）
（1）倒平板：电炉加热熔化其中一瓶60 mL营养 琼脂培养基。待培养基冷却到50℃左右（用手抓 瓶子不烫手）后，取3个无菌培养皿，每皿倒入 15～20mL培养基（自然铺满整个底面为准）， 等凝固后备用。
• 将接种好的试管斜面放到37℃培养箱中培养24h 后观察结果。
四、实验步骤
4. 倒平板（每组倒6或8块营养琼脂平板） （1）熔化培养基：电炉加热熔化120mL（或
160mL）那瓶营养琼脂培养基（电炉加热时 人要在旁边看着，防止培养基爆沸！）。 （2）倒平板：待培养基冷却到50℃左右（用 手抓瓶子不烫手）后，取无菌培养皿，每皿 倒入15～20mL培养基（自然铺满整个底面 为准），等凝固后备用。