第一向等电聚焦系统

第一向等电聚焦（IEF）
图示：Ettan IPGphor3等电聚焦仪器和Ettan IPGphor3控制软件双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。

IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。

可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。

IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。

最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。

1．IPG胶条的水化和电泳
（1）仪器：IPGphor
（2）试剂：水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓
冲液）：水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20℃保存，但不可反复冻融，尿素溶液加热温度不能超过37°C，否则蛋白会发生氨甲酰化)。

（3）实验步骤：
1）用样品溶解缓冲液(9M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mM DTT，40mM Tris-base)溶解样品。

蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml(若浓度过高，可以加Lysis buffer稀释)，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。

2）吸取适量(见表2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。

表2.1IPG胶条所需水化液体积
3）从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中（酸性端抵住胶条槽底端），慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。

4）IPG胶条上覆盖适量（1.5mL）Immobiline DryStrip覆盖油（从两侧往中间加），盖上盖子。

5）将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触（在此过程中，需用水平仪检查平台是否平衡，然后用两块白色条形板压在胶条槽上，最后盖上IPGphor的盖子）。

6）设置IPGphor仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。

电泳参数见表2.2 。

表2.2：IPGphor运行条件
低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。

7）IPG胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。

8）暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。

注意：不推荐每条IPG胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG胶条甚至会烧胶。

附注：一向等电聚焦电泳需21-22h
2．IPG 胶条的平衡
IPG 胶条平衡两次，每次15min 。

平衡缓冲液包括6M 尿素和30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。

第一步平衡在平衡液中加入DTT ，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾"point streaking") 。

将IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS 胶中。

注：如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG 胶条转移到SDS 胶的效率。

这种情况下建议在蛋白从 IPG 胶条转移到SDS 胶后，将IPG 胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG 胶条。

（1）仪器：平衡管 (200 mm 长, 20 mm i.d.), Parafilm, 水平式摇床
（2）实验步骤：
1）使用前每10ml 平衡缓冲液中加入0.1g DTT (相当于平衡缓冲液I )
，
取出IPG胶条分别放入平衡管中(支持膜贴着管壁，每个平衡管中放入一条IPG胶条)，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟，倒掉平衡缓冲液I。

2）每10ml平衡缓冲液加入0.3g碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液II)。

将IPG 胶条转移至平衡缓冲液II中，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟。

（注：平衡缓冲液Ⅰ和Ⅱ用同一平衡管，即先用DDT平衡，缓缓地倒掉DDT，小心别把IPG胶条倒掉，再加入IAA进行平衡即可。

每根胶条一般需10ml平衡液，如若要平衡3根胶条，洗2个50ml离心管，分别称量0.1g×3=0.3g DDT和0.3×3=0.9gIAA，各加入30ml）。

附注：在胶条平衡未完之前，进行剥胶，用ddH2O冲洗胶板，去除板上碎胶，并加满ddH2O置于支架上，一段时间后，将ddH2O倒掉，用滤纸片吸干水分，并吸取加热后的琼脂糖密封液灌满胶板空隙。

3）IPG胶条的转移：用镊子取出IPG胶条，将胶条的支持面（即带字的面，不能是胶面）边缘置于滤纸上几秒钟，以去除多余的平衡缓冲液，并将胶条浸泡在2×SDS电泳缓冲液中数秒钟。

然后，将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持面贴着其中的高板，用一薄尺将IPG胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。

确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。

4）最后往胶板空隙中补满琼脂糖密封液（温度不高于65℃），使IPG 胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡，放置一会儿，直至凝
固。

附注：配置新鲜上槽液1.2L=480mL+ddH2O至终体积（将5×Laemmli SDS 电泳缓冲液稀释至2×，加水至），用1mL的量筒配置并存放（因为在转移IPG胶条之前，先得在缓冲液中浸泡数秒钟）倒入Ettan DALTsix 上槽中，下槽液为1×电泳缓冲液，可重复利用。

缩略词表：
IPG：immobilized[ɪ'mobɪ,laɪz] PH gradient。