Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂

五、Matrigel体外侵袭实验所需：

1、Transwell 小室

2、上层培养液：含10g/L BSA的无血清培养液

3、细胞：实验细胞

4、基质胶：Matrigel基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20℃（至少保存3个月），呈固体状态。使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱冰上过夜（12h），Matrigel即融化为液体状态备用，避免反复冻融。在冰冻和解冻过程中可能会发生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀。Matrigel冰上维持液态，22～35℃可迅速凝结成胶，使用前接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

5、下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液

6、细胞培养板：12孔板，24孔板等

十二、Matrigel 体外侵袭实验

1.实验前的准备

(1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜，溶胶。

(2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

2．包被基底膜（冰上进行）

(1)冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。

(2)根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrigel胶（稀释比例根据不同细胞系，比例约为1：6～1：3）。

(3)将稀释胶包被于所需的Transwell上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120μl稀释胶加到12孔transwell上室中。

(4)37℃孵育1小时。

(5)去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗。

3.水化基底膜

吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。

4.制备细胞悬液

(1) 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12～24h，进一步去除血清的影响。

(2)常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，PBS洗1～2遍，用含10g/L BSA

的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1～10×105个/ml（一般不超过5×105个/ml）。

5.接种细胞

(1)取细胞悬液加入transwell小室。不同公司不、同大小的transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200μl，12孔板加

400μl。

(2)下室加入含FBS或趋化因子的培养基，24孔板一般加入500μl，12孔板加入800μl。特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

6.培养细胞

常规培养12～48小室（主要依据肿瘤细胞侵袭能力而定）。

7.染色和计数

(1)湿润的棉签擦去上室上面的费侵袭细胞

(2)用95%的无水乙醇或甲醛固定10分钟，在用蒸馏水洗3次。

(3)移去transwell，倒置风干。

(4)用0.005%结晶紫染色40分钟，蒸馏水洗3次。

(5)切膜，用液体石蜡固定，封片，显微镜观察。

十三、划痕实验

1、在6孔板底面利用直尺用记号笔每隔0.5～1cm均匀的划横线，每孔至少穿

过5条线。

2、在6孔板中加入5～8×105个细胞/孔，掌握为过夜能铺满。

3、第二天用无菌10μl枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂

直，不能倾斜。

4、分别在孵育0h、4h、8h、12h、24h时光学显微镜下测量伤痕距离并记录，

倒置显微镜下采集图像，观察各组细胞迁移情况。

5、绘制折线图，横坐标为时间，纵坐标为距离。

十四、MTT实验

1、接种细胞：用含10%FBS的培养液配成细胞悬液，以每孔1000～10000

个细胞接种96孔板，每孔体积200μl.

2、培养细胞：同一般培养条件，培养3～5天（可根据实验目的和要求决定

培养时间）。

3、呈色：培养3～5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20μl。继

续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需

要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μlDMSO，振荡10分钟，

使结晶物充分溶解。

4、比色：选择572nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录

结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：

1、选择适当的细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行实验。在呈色

后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与实验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他实验步骤

保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0～0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

IC50是半抑制率，是抑制50%的时候的药物浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，然后得到50%%抑制率时候的药品浓度，就是IC50。