Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂

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细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。

实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。

2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。

注意避免气泡的产生。

2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。

24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。

胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项一、MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，须被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

二、MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5 mg/mL。

因此，可以称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5 mg/mL保存在-20oC长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

细胞划痕实验操作步骤

细胞划痕实验操作步骤
细胞划痕实验（scratch assay）是一种简单、有效的方法，用于研究细胞迁移能力，常用于评估细胞愈合、癌细胞侵袭能力等。

下面是一个基本的细胞划痕实验操作步骤：
1. 细胞播种
在适宜的培养皿中（如6孔板）播种细胞，通常需达到90%以上的培养皿底面覆盖度，以形成一个单层细胞层。

这一步骤确保细胞能均匀分布在培养皿底部。

2. 形成划痕
在细胞长至接近合并（通常是培养24小时后）时，使用一个标准的200μl吸头尖、刻度尺或专用的划痕工具，在细胞层上轻轻划出一条直线，形成一个“划痕”。

要尽量保持划痕的宽度和长度一致，以方便后续的比较分析。

3. 清洗细胞
使用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻清洗培养皿1-2次，以去除漂浮的和受损的细胞。

4. 添加新的培养基
向培养皿中添加含有或不含有测试药物的新鲜培养基。

这一步是为了研究特定因子对细胞迁移能力的影响。

5. 拍摄初始照片
在划痕后立即使用倒置显微镜拍摄划痕的照片，作为实验的起始点。

6. 培养和定时拍照
将细胞置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。

在特定时间点（如6、12、24小时）取出，使用相同的显微镜设置拍摄划痕的照片，记录细胞迁移和划痕愈合的过程。

7. 数据分析
使用图像分析软件（如ImageJ）分析划痕愈合前后的面积或宽度变化。

通过比较划痕愈合的面积百分比或划痕宽度的变化，评估细胞迁移能力。

细胞划痕实验的结果可以通过计算划痕愈合的百分比来定量分析细胞迁移速度，为研究细胞迁移机制提供了一种简单有效的方法。

MTT实验步骤

MTT实验步骤普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT 的培养液。

5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。

MTT法检测细胞活性的操作方法

MTT法检测细胞活性的操作方法MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑）法是一种常用的细胞活性检测方法。

该方法基于MTT试剂的还原能力，通过测量细胞培养物中形成的紫色产物的光密度来评估细胞的活性及增殖水平。

以下是MTT法检测细胞活性的操作方法的详细步骤：1.实验前准备：1.1培养细胞：选择合适的细胞株，并在培养基中培养细胞。

1.2需要的材料准备：MTT试剂、PBS缓冲液、洗涤液（如DMEM/F12或PBS），消毒剂，离心管，显微镜片，吸管，96孔板等。

2.细胞处理：2.1 细胞接种：将培养好的细胞用消过毒的25cm2培养瓶等容器进行接种，使其达到适当的细胞浓度。

2.2细胞处理：根据实验需要，将细胞处理为不同的实验组和对照组。

3.细胞培养：3.1细胞培养：将细胞放在37°C的恒温培养箱中培养，直到细胞达到合适的生长状态。

3.2细胞传代：根据实验需要，将细胞进行传代。

4.细胞处理后的时间点采集：4.1细胞溶解：在处理后的适当时间点，用洗涤液洗涤一次细胞，并用PBS缓冲液将细胞溶解。

可根据需要使用离心或其他方法进行溶解。

4.2细胞计数：将溶解的细胞计数。

5.进行MTT反应：5.1 加入MTT试剂：将适量的MTT溶液（通常为5 mg/mL）加入到每个孔中，确保覆盖整个细胞，使细胞完全接触MTT溶液。

5.2孵育细胞：将孔板放在37°C恒温培养箱中孵育，孵育时间通常为2至4小时，具体时间根据实验需要进行调整。

5.3移除上清：用吸管或离心机将MTT溶液完全移除，避免产生气泡。

5.4加入溶剂：将150至200μL的溶剂（如DMSO）加入到每个孔中，溶解最终的产物。

充分振荡孔板，使产物完全溶解。

5.5 读取吸光度：使用酶标仪或分光光度计，在570 nm波长下读取吸光度。

6.数据分析：6.1数据读取：根据测得的吸光度值，将每组细胞的平均吸光度值记录下来。

6.2数据分析：根据实验设计和目标，进行适当的数据分析，例如细胞活性的百分比变化、细胞增殖速率等。

肿瘤的侵袭实验报告

一、实验目的本研究旨在探讨肿瘤细胞侵袭性及其相关机制，为肿瘤的防治提供理论依据。

通过体外侵袭实验，观察肿瘤细胞在细胞外基质上的侵袭能力，分析侵袭过程中相关信号通路和基因表达变化。

二、实验材料1. 细胞：人肺腺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、人结肠癌细胞系SW480。

2. 试剂：细胞培养试剂、Transwell小室、Matrigel基质胶、MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、Western blot试剂等。

3. 仪器：细胞培养箱、CO2培养箱、显微镜、酶标仪、PCR仪、凝胶成像系统、Western blot成像系统等。

三、实验方法1. 细胞培养：将A549、MCF-7、SW480细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期后进行实验。

2. Transwell侵袭实验：将Matrigel基质胶铺于Transwell小室的上室，将细胞悬液加入下室，上室加入适量细胞培养液。

培养24小时后，用棉签轻轻刮去未侵袭细胞，将小室取出，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察侵袭细胞数量。

3. MTT实验：将细胞悬液加入96孔板，培养24小时后，加入MTT溶液，继续培养4小时，酶标仪检测吸光度值，计算细胞活力。

4. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液加入流式细胞仪检测管中，加入Annexin V-FITC和PI染料，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5. RNA提取、反转录和PCR：提取细胞总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增，分析侵袭相关基因表达。

6. Western blot：提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，加入一抗和二抗，Western blot成像系统检测蛋白表达。

四、实验结果1. Transwell侵袭实验：与正常细胞相比，肿瘤细胞侵袭能力显著增强。

MTT实验原理、步骤、注意事项

MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂

Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂五、Matrigel体外侵袭实验所需：1、Transwell 小室2、上层培养液：含10g/L BSA的无血清培养液3、细胞：实验细胞4、基质胶：Matrigel基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20℃（至少保存3个月），呈固体状态。

使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱冰上过夜（12h），Matrigel即融化为液体状态备用，避免反复冻融。

在冰冻和解冻过程中可能会发生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀。

Matrigel冰上维持液态，22～35℃可迅速凝结成胶，使用前接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

5、下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液6、细胞培养板：12孔板，24孔板等十二、Matrigel 体外侵袭实验1.实验前的准备(1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜，溶胶。

(2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。

2．包被基底膜（冰上进行）(1)冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。

(2)根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrigel胶（稀释比例根据不同细胞系，比例约为1：6～1：3）。

(3)将稀释胶包被于所需的Transwell上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120μl稀释胶加到12孔transwell上室中。

(4)37℃孵育1小时。

(5)去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗。

3.水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。

4.制备细胞悬液(1) 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12～24h，进一步去除血清的影响。

(2)常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，PBS洗1～2遍，用含10g/L BSA 的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1～10×105个/ml（一般不超过5×105个/ml）。

MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

四、MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项1、MTT：MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

2、MTT用途：（1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；（2）细胞增殖及细胞活性测定。

3、原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）颗粒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒颗粒，用酶标仪在490nm波长处（也有测D570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

4、实验材料：（1）MTT的配制：通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml，须用无菌PBS或生理盐水做溶剂。

注意事项：厂家都是将MTT放入小管中的，建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液。

细节如下：预先在50ml离心管加入20ml PBS（PH=7.4），从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)，可长期保存于-20℃，避免反复冻融。

当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套。

（2）MTT甲瓒溶解液：DMSO（二甲基亚砜）：可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

MTT原理步骤结果分析方法及注意事项

MTT原理步骤结果分析方法及注意事项MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用于细胞增殖和细胞存活率测定的试剂。

MTT会被细胞还原成紫色的 MTT 衍生物，进而被细胞摄入和积蓄。

然后，MTT 衍生物可以通过去酸化和水解得到溶于有机溶剂的紫色形成物，可以用分光光度计检测。

MTT法常用于评估细胞毒性、细胞增殖、细胞存活率以及细胞治疗试验中药物、化合物和生物活性物质的毒性和活性。

1.细胞处理：将待测样品的细胞接种于孔板或培养皿中，使细胞附着在底部。

2.细胞培养：将细胞培养在适宜的培养条件下，使其稳定生长。

3.MTT染色：加入MTT溶液到细胞培养中，使其与细胞接触。

4.MTT还原：细胞将MTT还原为紫色产品，该产物由于不能从细胞中扩散出来，只会在细胞内积累。

5.细胞裂解：加入溶解MTT的溶剂，破坏细胞壁，并使其紫色产物完全溶解。

6. 分光光度计测定：使用分光光度计在570nm波长下测量吸光度。

7.数据分析：将吸光度的读数与对照组比较，计算细胞生长或存活率。

MTT法的结果分析方法如下：1.计算细胞生长或存活率：将待测组（实验组）细胞的吸光度读数减去空白对照组的吸光度读数，以消除背景干扰。

然后，将差值与对照组的吸光度读数进行比较，计算细胞的增殖或存活率。

2.绘制生长曲线：将不同时间点的吸光度读数绘制成图表，以观察细胞的增殖情况。

3.IC50测定：通过绘制浓度-响应曲线，确定50%细胞抑制浓度（IC50），即需要的试剂浓度来抑制细胞增殖或杀死50%的细胞。

注意事项如下：1.细胞密度：细胞密度应保持在适宜的范围，以确保实验结果的准确度。

过高的细胞密度可能导致细胞受限和死亡，而过低的细胞密度可能导致结果不可靠。

2.MTT浓度：MTT浓度的选择应根据具体实验目的和细胞类型进行优化。

浓度太高可能会导致染色不均匀，浓度太低可能影响实验结果的敏感性。

肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明

肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。

铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。

细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。

穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。

另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。

值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。

肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。

在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。

另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。

2019年MTT实验方法步骤

2019年MTT实验⽅法步骤⼀．悬浮细胞MTT实验时,由于离⼼弃上清会造成⼀定程度的细胞丢失,⽽且操作⼜⿇烦.请教各位⽼师,不⽤弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的⽅法的具体步骤和参考⽂献.谢谢!1．介绍⼀种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加⼊1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加⼊不同浓度的MDP。

收集对数⽣长期的UMR106细胞，调整细胞浓度⾄1×108/L，加⼊各孔，效靶⽐（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。

每孔取100µl的UMR106细胞移⼊96孔培养板，各孔加⼊5g/LMTT20µl，培养4h，再加⼊10％SDS100µl，测定570nm处的A值。

计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本⽅法参考⽂献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～4162．SRB是⼀种活性蛋⽩染料，能与细胞蛋⽩的碱性氨基酸结合⽽显⾊，在490nm~520nm 波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。

SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新⽅法，相对于结晶紫法或⽬前普遍采⽤的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。

除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染⾊仅需90分钟左右，⽽MTT加样后还需培养4⼩时。

(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。

MTT实验步骤

MTT实验步骤详细流程最后更新：2011-1-11 阅读次数：6655 【字体：小中大】MTT常用浓度为5mg/ml。

1、药物的细胞毒性四唑盐（MTT）比色法操作步骤接种细胞（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

（2）离心细胞悬液，使细胞沉积下来。

用培养基重悬细胞，计数。

（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。

（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。

（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。

第1列作读板议的空白对照。

（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。

添加药物（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。

（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。

（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。

每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。

（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。

（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。

生长期（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。

（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。

存活细胞数的估算（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。

（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。

（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。

（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。

环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化-雷萌生物

环形细胞侵袭实验--使细胞侵袭的过程可视化肿瘤细胞的侵袭能力是肿瘤转移的一个重要特征。

为了研究肿瘤细胞侵袭过程的机制，一系列体外细胞实验建立起来，用于研究细胞侵袭基底膜和基质的过程。

体外侵袭实验首先是采用人工重构基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐渐凝固成胶，结构与天然基质膜结构极为相似。

通常的实验是在孔径8μm的滤膜上铺上一层Matrigel，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过。

实验之后通过对穿过“基质膜”的细胞进行计数，来确定细胞的侵袭能力。

这一方法非常仿真的模拟了细胞在生理状态下的侵袭过程，但是其也有一定的局限性。

由于滤膜的不透光性，使得直接观察细胞伪足和骨架变化变得非常困难。

英国的科研人员改进了肿瘤侵袭实验，设计了一种环形细胞侵袭实验，使得操作进一步简化，并且也能模拟3D侵袭。

最重要的是，能够使侵袭过程中的活细胞或者是固定的细胞可视化。

借用这个实验方法，研究人员发现侵袭过程中主要有蛋白酶参与其中。

研究发现，在3D侵袭的细胞中蛋白酶会聚集在伪足和细胞的粘附点上。

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion AssayX. Yu and L. M. MacheskyPLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605（一）实验材料1)细胞: MDA-MB-2312)实验耗材: 伤口愈合插件（ibidi，80209）玻璃底培养皿（ibidi，81158）3)试剂: Matrigel （BD）4%多聚甲醛溶液0.1%Triton X-100（二）实验步骤●将ibidi伤口愈合插件放入ibidi玻璃底培养皿中间●在插件外部铺6 × 105 MDA-MB-231细胞，等待细胞贴壁●细胞贴壁后移除伤口愈合插件，在细胞中心形成一个0.8cm2的空白区域●加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），将培养皿内层刚好铺满，能形成一个0.8mm厚度的“基质膜”●孵育2小时，使Matrigel完全固化，加入培养基●在37。

Transwell侵袭实验操作步骤

Transwell侵袭实验操作步骤
1、实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。

2、包被基底膜：Matrigel基质胶以1：8稀释后包被transwell 小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作，否则Matrigel在10℃以上即会凝固)，3小时风干。

3、水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

4、常规胰酶消化细胞，PBS洗1-2遍去除血清的影响，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5*105个/mL。

5、取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室，24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。

注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。

6、培养板置于37℃的CO2培养箱中，依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。

7、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，结晶紫溶液染色15 min。

8、倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。

细胞侵袭实验步骤

Cell invasion protocols实验材料：1、24 transwell2、Matrigel 基质胶Becton-dickinson（BD）公司Matrigel 在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。

使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化过夜（避免反复冻融）。

注：使用时需接触Matrigel 的试管、移液吸头等均应预冷于-20℃；3、Diff-Quick染色溶液4、镊子5、棉签实验步骤1、matrigel在4℃自然融化（用多少，转移多少）过夜。

2、将实验使用的微量注射枪及枪头(蓝、黄枪头）在-20℃预冰。

3、500ul matigel + 500ul DMEM（不含牛血清且在4℃预储藏贮藏的）4、有枪头轻混匀。

5、分别在24-trans well 正中的8孔的上腔室中，加入该混合液70ul/孔。

6、在超净台（UV+ fan) 干燥3--4h7、待matrigel干燥后，抽去上层DMED，用500ulPBS轻清洗凝胶。

8、消化细胞，洗细胞（3次）重选细胞100ul（5×104）MCF-7细胞于上室中。

9、抚育待细胞贴壁生长后（由细胞生长情况而确定抚育时间）10、给药。

上室给药（无血清培养液），下室不给药（血清中含有5%-10%FBS），上室、下室培养液体积为500ul。

11、抚育24h。

12、染色：将小室从24孔板中取出，用Diff-Quick solution染色液染色。

13、用擦去transell 上层细胞，从底部将膜切下，粘在载玻片上并盖上盖玻片，于显微镜下取若干视野进行观察。

（此方法可长期保存，但transwell只能使用一次，还有其他染色方法可以借鉴，见其他参考文献，请参考）。

transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备1。

无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原(collagen）的话,一般配成0。

5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel （3.9 ug/ul) 60-80 µl （注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶.2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液.二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1—10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果.如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。