TAKARA双酶切表
双酶切体系
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表之迟辟智美创作
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行.TaKaRa采纳Universal Buffer暗示系统，并对每种酶暗示了在各Universal Buffer中的相对活性.尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer.本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件.在本表中，各Universal Buffer之前暗示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度.TaKaRa销售产物中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液.终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用.
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA.◇为防止Star 活性的发生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下.◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的分歧，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能.。
双酶切体系梳理
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表■ 说明使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意◇1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。
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DNA限制性内切酶——双酶切反应时通用缓冲液及选用
DNA限制性内切酶——双酶切反应时通用缓冲液的选用
■当酶切位点确定后，最好购买同一家公司生产同一类型的内切酶（若酶切Buffer相同，这样有时候可以省去后期去需找酶切反应通用缓冲液）
■说明
使用两种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。
双酶切体系
Double Digestion（双酶切反应）时Universal Buffer（通用缓冲液）的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应（Double Digestion）时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统, 并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion 时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的［数字刃是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5 x
时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1X时稀释至10倍，2X时稀释至5倍进行使用。
■注意
◊1 （i g DNA中添加10 U的限制酶，在50 口的反应体系中，37 C下反应1小时可以完全降解DNA。
◊为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◊根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生
Double Digestion不能顺利进行的可。
双酶切体系
Double Digestion(双酶切反响)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表之樊仲川亿创作
时间：二O二一年七月二十九日
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反响(Double Digestion) 时,为了节省反响时间,通常希望在同一反响体系内进
行.TaKaRa采取Universal Buffer暗示系统,并对每种酶暗示了在各Universal Buffer中的相对活性.尽管如此,在进行Double Digestion时,有时还会难以找到合适的Universal Buffer.本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心,显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件.在本表中,各Universal Buffer之前暗示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反响体系中的最终浓度.TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液.终浓度为0.5×时反响体系中的缓冲液则稀释至20倍,1×时稀释至10倍,2×时稀释至5倍进行使用.
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶,在50 μl的反响体系中,37℃下反响1小时可以完全降解DNA.◇为避免Star活性的产生,请将反响体系中的甘油含量,尽量控制在10%以下.◇按照DNA的种类,各DNA的立体结构的不同,或当限制酶识别位点邻接时,有时会产生Double Digestion不克不及顺利进行的可能.
时间：二O二一年七月二十九日。
双酶切鉴定
四、双酶切鉴定㈠双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
㈡连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些
DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解：TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。
NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。
NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。
应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1 酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。
不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1.为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz7031yz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2.电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点，由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一，在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切（Alu1酶）后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了，回收还是达不到浓度（大约只有0.06微克\微升），又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。
请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。
说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80%乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。
双酶切Buffer说明
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■ 说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
Takara采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer 的反应体系中的最终浓度。
Takara销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇ 为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇ 根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion。
质粒的双酶切
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TTC ……3’
3’…… C T T|AA’G …...5’
|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是 回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各 有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合”
• 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
• 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情 况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上 切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类 限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结 构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等
E5’c…oR…ⅠG酶’A（A切T|TaTK割CaR…a后公…司3形’） 成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来 1Ⅱ0×型H限B制➢u性ffe内rⅢ切型酶能限识别制专一性的内核苷切酸顺酶序也，并有在该专顺序一内的的固识定位别置顺上切序割双，链。但不是对称的回文顺序，在 3’…… CTA’|识TAG别……顺5’序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸 由这于类这 酶类如限Ec制o对B性、内不Ec切oK是酶等的特识别异和切性割的的核。苷酸因都是此专一，的这。 种限制性内切酶切割后产生的一定长度 这但类这限 几制个性核内苷D切酸N酶对A在不片是DN特A段异重性组，的技具。术或有基因各工种程中单用处链不末大，端无法。用因于分此析D不NA能结构应或用克隆于基因基。因克隆
双酶切体系
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表之巴公井开创作
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采取Universal Buffer暗示系统，并对每种酶暗示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前暗示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star 活性的发生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的不同，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不克不及顺利进行的可能。
双酶切
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则 就可能造成酶切失败。
李婷王鹏飞王鹏飞高峰高峰实验原理实验原理用限制性内切酶去切割dna片断由于酶具有专一性一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列所以可以用特定的这种酶去切割相应的dna片断进而达到定向切割的目的
双酶切及连接
指导老师：陈思 组员：李婷 王鹏飞 高峰 姜威 邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
TaKaRa Universal Buffer 宝生物双酶切缓冲液-推荐下载
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可
能。
双酶切Buffer说明
双酶切Buffer说明Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表■ 说明使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
Takara采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer 中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer 的反应体系中的最终浓度。
Takara销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇ 为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇ 根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion 不能顺利进行的可能。
Enzyme Acc I Bam H I Bgl II Cla I Eco R I Eco R V Hin c II Hin d III Kpn I Nco I Nde IAcc I－0.5×K1×T1×M1×M0.5×K1×M1×M1×M 1×M+BSA1×TBam H I0.5×K－1×K1×K1×K1×K0.5×K1×K0.5×K 1×K+BSABgl II1×T1×K－1×H1×H1×H2×K1×K1×T 1×K+BSA1×HCla I1×M1×K1×H－1×H1×H1×M1×M1×M 1×K+BSA1×HEco R I1×M1×K1×H1×H－1×H1×M1×M1×M 1×K +BSA1×HEco R V0.5×K1×K1×H1×H1×H－2×T1×K0.5×K 1×K +BSA1×HHin c II1×M0.5×K2×K1×M1×M2×T－1×M1×M 1×M +BSA1×THin d III1×M1×K1×K1×M1×M1×K1×M－1×M 1×K +BSA1×KKpn I1×M0.5×K1×T1×M1×M0.5×K1×M1×M－0.5×K +BSA1×TNco I 1×M+BSA1×K+BSA1×K+BSA1×K+BSA+BSA1×K+BSA1×M+BSA1×K+BSA0.5×K+BSA－1×K+BSANde I1×T1×K1×H1×H1×H1×H1×T1×K1×T 1×K +BSA－Not I 0.5×K+BSA0.5×K+BSA1×H+BSA1×H+BSA1×H+BSA1×H+BSA0.5×K+BSA+BSA0.5×K+BSA0.5×K+BSA1×H+BSAPst I1×M1×K1×H1×H1×H1×H1×M1×M1×M 1×K+BSA1×HPvu I0.5×K1×K1×K1×K1×K1×K0.5×K1×K0.5×K 1×K+BSA1×KSac I1×M0.5×K0.5×K1×M1×M0.5×K1×M1×M1×L 0.5×K +BSA1×TSal I 1.5×T 1.5×T1×H1×H1×H1×H 1.5×K 1.5×K 1.5×T +BSA1.5×T+BSA1×HSma I 1×T+BSA0.5×T+BSA1×T+BSA1×T+BSA+BSA0.5×K+BSA1×T+BSA1×T+BSA1×T+BSA1×T+BSA1×T+BSASpe I1×M1×K1×H1×M1×H1×H1×M1×M1×M 1×K+BSA1×HSph I0.5×K1×K1×H1×H1×H1×H2×T1×K0.5×K 1×K+BSA1×HXba I1×M0.5×K2×T1×M1×M2×T1×M1×M1×M 1×M+BSA1×TXho I1×M1×K1×H1×H1×H1×H1×M1×M1×M 1×K+BSA1×HEnzyme Not I Pst I Pvu I Sac I Sal I Sma I Spe I Sph I Xba I Xho IAcc I 0.5×K+BSA1×M0.5×K1×M 1.5×T1×T+BSA1×M0.5×K1×M1×M Bam H I0.5×K+BSA 1×K1×K0.5×K 1.5×T 0.5×T+BSA1×K1×K0.5×K1×KBgl II1×K+BSA 1×H1×K0.5×K1×H 1×T+BSA1×H1×H2×T1×HCla I1×K+BS A 1×H1×K1×M1×H 1×T+BSA1×M1×H1×M1×HEco R I1×K+BSA 1×H1×K1×M1×H 1×T+BSA1×H1×H1×M1×HEco R V1×K+BSA 1×H1×K0.5×K1×H 0.5×K+BSA1×H1×H2×T1×HHin c II0.5×K+BSA 1×M0.5×K1×M 1.5×K 1×T+BSA1×M2×T1×M1×MHin d III0.5×K+BSA 1×M1×K1×M 1.5×K 1×T+BSA1×M1×K1×M1×MKpn I0.5×K+BSA 1×M0.5×K1×L1.5×T+BSA1×T+BSA1×M0.5×K1×M1×MNco I0.5×K+BSA 1×K+BSA1×K+BSA0.5×K+BSA1.5×T+BSA1×T+BSA1×K+BSA1×K+BSA1×M+BSA1×K+BSANde I1×H+BSA 1×H1×K1×T1×H 1×T+BSA1×H1×H1×T1×HNot I－1×H+BSA2×K+BSA0.5×K+BSA1×H+BSA0.5×T+BSA1×H+BSA1×H+BSA0.5×K+BSA1×H+BSAPst I1×H+BSA －1×K1×M1×H 0.5×T+BSA1×H1×H1×M1×H Pvu I2×K+BSA 1×K－0.5×K 1.5×K+BSA1×K+BSA1×K1×K0.5×K1×K Sac I0.5×K+BSA 1×M0.5×K－1.5×T+BSA1×T+BSA1×M0.5×K1×M1×M Sal I1×H+BSA 1×H1.5×K+BSA1.5×T+BSA－1.5×T+BSA1×H1×H 1.5×T1×H Sma I0.5×T+BSA 0.5×T+BSA1×K+BSA1×T+BSA1.5×T+BSA－1×T+BSA0.5×T+BSA1×T+BSA1×T+BSASpe I1×H+BSA 1×H1×K1×M1×H1×T+BSA－1×H1×M1×HSph I1×H+BSA 1×H1×K0.5×K1×H 0.5×T+BSA1×H－2×T1×HXba I0.5×K+BSA 1×M0.5×K1×M 1.5×T 1×T+BSA1×M2×T－1×MXho I1×H+BSA 1×H1×K1×M1×H 1×T+BSA1×H1×H1×M－。
DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性
DNA限制性内切酶——酶切Buffer组分及其活性TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液(Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系(5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。
并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。
有( ) 标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。
每种限制酶都有其自身的基本缓冲液(Basal Buffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、Psh BⅠ、Sna BⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。
各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。
各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。
限制酶在各种缓冲液中的相对活性附带·活性测定用Buffer 推荐使用的Buffer*1+0.01%BSA→100%:Afl II, Aor13H I, Eco O65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%:Not I*3不加BSA按Universal Buffer分类的限制酶各Universal Buffer的组成■ 使用注意事项10×Buffer都为10倍浓度的缓冲液。
此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度(0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。
酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。
确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。
并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。
当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核昔酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1 A 260单位的寡核昔酸。
取1 Q已标记了的寡核昔酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6） , 10 mM MgCI 2,5 mM DTT S适量的NaCI 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核昔酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90参看目录，选择共同的buffero其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
切。
3. 酶切底物DNA ,切不开1 ）底物DNA±没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。