3-3 简述谷氨酸高产菌株代谢控制育种的基本思想。

第三讲 代谢控制育种的基本思想
一、切断捉支路代谢
一、切断支路代谢
1. 选育营养缺陷型突变株
由于营养缺陷突变株合成途径中某一步 骤发生缺陷，致使终产物不能积累，因此， 也就遗传性地解除了终产物的反馈调节，使 得中间产物或另一分支途径的未端产物得以 积累。另外，它还可以起到节省碳源的作用。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
图3-2 酶活性抑制调节
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
• 如果是调节基因发生突变，阻遏物就不能再与
代谢拮抗物结合。这种突变型是一个抗反馈阻
遏突变型。 • 其正常代谢的最终产物不与结构发生改变的阻 遏蛋白相结合，所以在细胞中尽管已经有大量 最终产物，仍能不断地合成有关的酶。
柠檬酸合成酶
柠檬酸
异柠檬酸裂解酶 顺乌头酸酶
苹果酸
乙醛酸
α-酮戊二酸脱氢酶
异柠檬酸
异柠檬酸脱氢酶
反丁烯二酸 设法强化的代谢流
琥珀酸
α-酮戊二酸
谷氨酸脱氢酶
切断或减弱的代谢流
谷氨酸 细胞膜渗透性 谷氨酸
第三讲 代谢控制育种的基本思想 谷氨酸生物合成的调节机制
四、去除终产物
（4）受天冬氨酸 的反馈抑制，受 谷氨酸和天冬氨 酸的反馈阻遏。
一、切断捉支路代谢
2. 选育渗漏缺陷突变株
渗漏缺陷突变株能够少量地合成某一
种代谢最终产物，能在基本培养基上进行
少量的生长。因其不能合成过量的最终产
物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代
谢产物的积累。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
二、解除菌体自身的反馈调节 1. 选育抗类似物突变株
第三讲 代谢控制育种的基本思想
本讲研讨题
第三讲 代谢控制育种的基本思想
3. 简述谷氨酸高产菌株代谢控制育种的基本思想。
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第三讲 代谢控制育种的基本思想
基本内容
第三讲 代谢控制育种的基本思想
一、切断支路代谢
1. 选育营养缺陷型突变株 2. 选育渗漏缺陷突变株 3. 选育营养缺陷回复突变株
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
调节中心（或称变构中心）
活性中心 变构酶 调节中心
与底物结合
起催化作用
与最终产物结合 改变酶的构象 （影响底物与酶的结合）
这种结合是可逆的，当终产物浓度降低时，终产
物与酶的结合随即解离，从而恢复了酶蛋白的构象，
酶重新与底物结合发生催化作用。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最
适条件不同。 以葡萄糖为碳源时，乙醛酸循环活性越高，谷氨酸生成收率越低。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
四、去除终产物
异柠檬酸
异柠檬酸脱氢酶
α－酮戊二酸
谷氨酸脱氧酶
谷氨酸
NADP+
NADP+
NADPH2
NH4+
图3-6 异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的偶联共轭反应
结构类似物： 在化学和空间结构上和代谢的中 间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可 以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞 不能以其作为自身的营养物质。
•
如果是变构酶结构基因发生突变，变构酶调节部位
就不能再与代谢拮抗物相结合，而其活性中心却不变。
这种突变型就是一个抗反馈抑制突变型。 • 正常代谢最终产物由于与代谢桔抗物的结构相类似， 所以在这一突变型中也不与结构发生改变的变构酶相 结合。这样，该突变型细胞中已经有大量最终产物， 但仍能继续不断地合成。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
柠檬酸合成酶 （3）受顺乌头酸的反馈抑 制和谷氨酸的反馈阻遏。 异柠檬酸脱氢酶 谷氨酸脱氢酶 （2）受α-酮戊二酸的 反馈抑制。
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（1）受谷氨酸的反馈抑 制和反馈阻遏。
图3-7 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
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第三讲 代谢控制育种的基本思想
四、去除终产物
3. 谷氨酸生产菌产物积累机制 TCA循环α-酮戊二酸脱氢酶行活力丧失或微弱， 使α-酮戊二酸继 续氧化能力丧失或微弱。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力强，使草酰乙酸全部由CO2固定反 应提供。 谷氨酸脱氢酶活力很强，并不受谷氨酸的反馈抑制和反馈阻遏。 谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的共轭反应，有利于α-酮戊二酸氨 基化生成谷氨酸。
二、解除菌体自身的反馈调节
1. 选育抗类似物突变株 2. 酶特性的利用 3. 选育营养缺陷回复突变株
三、增加前体物的合成 四、去除终产物
第三讲 代谢控制育种的基本思想
基本内容
代谢控制育种的有效措施
• 利用代谢控制理论，选育从遗传角度解除了微生物正常 代谢调节机制的突变株，即可突破微生物的自我调节控制机 制，而使代谢产物大量积累的高产菌有效措施如下： ⑴ 选育营养缺陷突变株 ⑵ 选育抗反馈调节的突变株 ⑶ 选育细胞膜通透性突变株 ⑷ 选育营养缺陷型回复突变株或条件突变株 ⑸ 应用遗传工程技术，构建目的基因工程（重组）菌株
赖氨酸
O-乙酰高丝氨酸 优先合成 反馈控制
苏氨酸
苏氨酸 脱氨酶
蛋氨酸
异亮氨酸
图3-5 黄色短杆菌的赖氨酸合成调节机制
第三讲 代谢控制育种的基本思想
三、增加前体物的合成
如图3-5所示： ●选育异亮氨酸产生菌时为积累异亮氨酸， 应解除对异亮氨酸合成的反馈抑制，还应解除异 亮氨酸前体苏氨酸的反馈控制。
●苏氨酸和异亮氨酸的关键酶高丝氨酸脱氢
措施：
1. 限量添加生物素 2. 选育油酸缺陷型 3. 选育甘油缺陷型 4. 添加脂肪酸类似物 5. 加青霉素
与脂肪酸合成有关，间接影响细胞 膜合成
不能作为细胞膜合成的成分
影响细胞壁合成
第三讲 代谢控制育种的基本思想
四、去除终产物
谷氨酸生产菌产物积累机制
葡萄糖
丙酮酸
乙酰CoA
CO2固定反应 草酰乙酸
解除对前体物合成的调节。
使分支点中间产物增多，目的产物积累。 克隆合成途径中关键酶，使其大量扩增，增加目的产物前体， 提高产量。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
三、增加前体物的合成
⑴ 切断目的产物外的其他控制共用酶终产物的分支途径
葡萄糖
L-氨基酸
α-丙酮 丙氨酸
丙酮酸
协同反馈抑制
天冬氨酸
天冬氨 酰半醛
酶（HD）受苏氨酸反馈抑制。
● 选育抗低浓度（α—氨基）—β—羟戊酸
（AHV）突变株，异亮氨酸产量明显提高。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
四、去除终产物
四、去除终产物
改变细胞膜渗透性，将终产物不断排出胞外，使终产物不至积累到 引起反馈抑制的浓度，可预防反馈抑制。
生物素是脂肪酸合成初始酶的辅酶，参 与脂肪酸合成，脂肪酸是细胞膜磷脂主 要成分，从而间接干扰细胞膜合成
三、增加前体物的合成
三、增加前体物的合成
通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株及克隆某些关
键酶的方法，增加目的产物前体物的合成，有利于目的产物大量积累。
分支合成途径中，切断目的产物外的其他控制共用酶终产物的
分支合成途径，增加目的产物前体。 别的终产物是目的产物前体，解除目的产物自身合成反馈调节，
图3-4 黄色短杆菌的谷氨酸与天冬氨酸生物合成的调节机制
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
3. 选育营养缺陷回复突变株
当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状后，经过回
复突变可以再恢复其原有的遗传性状。
这是因为当某一结构基因发生突变后，该结构基因所编 码的酶就因结构的改变而失活。
二氢吡啶 二羧酸 亮氨酸
赖氨酸
苏氨酸
反馈抑制
阻遏
图3-4 在乳糖发酵短杆菌中赖氨酸、丙氨酸的生物合成途径及其调节
第三讲 代谢控制育种的基本思想
三、增加前体物的合成
如图3-4所示： ●天冬氨酸处为分支点，有2条途径，分别 通向赖氨酸和丙氨酸。 ●选育了解除赖氨酸反馈调节突变株的基 础上增加丙氨酸营养缺陷标记，使代谢流向更 多通向赖氨酸，提高赖氨酸产量。
而经过第二次突变（回复突变）后，该酶的活性中心结
构可以复原，而调节部位的结构常常并没有恢复。结果是一 方面酶恢复了酶的催化活性，而另一方面反馈抑制却已解除 或不怎么严重。
高产菌株的回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导
致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
第三讲 代谢控制育种的基本思想
三、增加前体物的合成
⑵ 解除目的产物前体合成的反馈调节
天冬氨酸
天冬氨酸激酶Βιβλιοθήκη Baidu
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸半醛脱氢酶
天冬氨酰半醛
二氢吡啶-2,6二羧酸还原酶 高丝氨酸脱氢酶
二氢吡啶二羧酸
二氢吡啶-2,6二羧酸合成酶 O-琥珀酰高丝 氨酸转琥珀酰 酶
高丝氨酸
高丝氨酸激酶
O-磷酸高丝氨酸
磷酸烯醇式丙酮酸
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
草酰乙酸
TA
天冬氨酸
柠檬酸
改变细胞膜渗透
TCA循环
α-酮戊二酸
谷氨酸 脱氢酶
性，使谷氨酸不 在细胞内积累， 提高谷氨酸产量。
谷氨酸
优先合成
反馈控制
谷氨酸优先合成，当其过剩→反馈抑制谷氨酸脱氢酶（GD）， 使合成转向天冬氨酸，天冬氨酸过量→反馈控制磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶（PC），这时，谷氨酸不积累。
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节
酶合成的调控
由代谢终产物抑制酶合成的负反馈作用称为反馈阻遏
无辅阻遏物，结构基因表达
有辅阻遏物，结构基因不能表达
图3-3 反馈阻遏酶合成示意图
R—调节基因； P—启动基因； O—操纵基因； S—结构基因
第三讲 代谢控制育种的基本思想
二、解除菌体自身的反馈调节