聚合酶链反应的原理和应用
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。
这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。
参与复制的有多种因素。
PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术，可通过扩增特定DNA片段数量来进行定量分析。
PCR定量方法的发展使得我们能够更加准确、快速地测量和定量目标DNA序列或基因表达水平。
本文将概述PCR定量方法的原理、步骤和应用。
一、PCR定量方法的原理PCR定量方法是基于PCR技术的扩增效率与起始模板浓度成正比的原理。
在PCR反应中，模板DNA以指数级倍增，而每个PCR周期后，扩增效率会逐渐降低。
通过确定PCR周期数和目标序列浓度之间的关系，可以利用定标曲线或计算方法来定量目标DNA的起始浓度。
二、PCR定量方法的步骤1. DNA提取：从样本（如细胞、组织或血液）中提取DNA，并纯化得到高质量的模板DNA。
2. 靶序列选择：根据需要定量的目标序列，设计引物和探针，保证其特异性和高效性。
3. PCR反应设置：根据目标序列的长度和特性，确定PCR反应体系中的引物和探针的浓度，优化反应条件（如温度和时间）。
4. 制备标准曲线：通过系列稀释的已知浓度的标准品，构建定标曲线，用于后续定量计算。
5. PCR扩增：将模板DNA与引物和探针加入PCR反应体系中，进行一系列PCR循环，扩增目标序列。
6. 实时监测：利用实时荧光PCR仪或其他检测方法，监测PCR反应过程中探针的荧光信号强度。
7. 数据分析：根据定标曲线和荧光信号强度，计算出目标DNA的起始浓度。
三、PCR定量方法的应用1. 基因表达分析：通过比较不同样品中目标基因的表达水平，研究基因在生理和病理过程中的变化。
2. 病原体检测：定量PCR可用于检测和定量病原体DNA，用于快速诊断与预后评估。
3. 肿瘤检测：通过定量PCR检测肿瘤标志物，提供肿瘤早期诊断和治疗效果监测。
4. 遗传病筛查：利用PCR定量方法可以检测和定量与遗传病相关的突变或多态性位点。
5. GMO检测：定量PCR可用于识别和量化转基因生物的成分和含量。
6. 受精能力评估：通过检测精子和卵子中特定基因的数量，评估生殖健康和受精能力。
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用简介聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）是一种用于复制DNA序列的技术，可以在短时间内扩增少量的DNA样品，被广泛应用于临床诊断、基因工程等领域。
PCR技术的原理基于DNA的复制能力，采用DNA聚合酶酶解、引物扩增、芯片分析等技术，可以快速诊断出各种疾病。
本篇文章将介绍PCR技术在临床诊断中的应用，以及其优缺点。
PCR技术在临床诊断中的应用PCR技术可以用于快速检测许多疾病的标记物，如肿瘤标记物、传染病标记物等。
在临床上，PCR技术被广泛应用于快速准确诊断疾病、分子诊断和治疗流程中。
1. 传染病检测PCR技术在传染病检测中可以提高检测速度、灵敏度和特异性。
通过PCR技术检测病菌DNA或RNA，可以在病人感染后的短时间内，准确检测出病原体，如肺结核、流感、病毒性肝炎等传染病。
与传统的检测方法相比，PCR技术的检测结果更加可靠，能够避免虚假阳性或阴性的影响，提高了诊断准确性。
2.遗传病检测PCR技术在遗传病检测中可以通过扩增特定基因区段的方法，检测患者是否携带有致病基因突变，包括：遗传性失听症、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种遗传病。
PCR技术使得医生可以在患者出现症状前就进行诊断，为早期预防和治疗提供了更加可靠的科学依据。
3. 肿瘤检测PCR技术在肿瘤检测中可以检测出特定肿瘤相关基因和基因突变，如白血病、乳腺癌、早期子宫内膜癌和黑色素瘤等。
与传统的检测方式相比，PCR技术可以在较短时间内完成诊断，并对肿瘤的类型和治疗方案进行评估，有利于肿瘤治疗的个体化。
PCR技术的优缺点1. 优点（1）快速：PCR技术只需要数小时就可以得到具有高灵敏性和特异性的评估结果。
（2）灵敏：PCR技术可以扩增极小量的DNA，并能够检测数量几乎无限制的目标基因组。
（3）特异性：PCR技术利用引物定向扩增目标DNA，可以避免与非目标的DNA序列结合而误诊的风险。
聚合酶链反应技术在疾病诊断中的应用
聚合酶链反应技术在疾病诊断中的应用聚合酶链反应技术，简称PCR技术，是一种利用DNA聚合酶在体外辅助DNA复制的技术。
它具有高度的灵敏度和特异性，能够在短时间内扩增极少量的DNA分子，因此被广泛应用于疾病的诊断和检测。
PCR技术的原理和步骤PCR技术是一种体外人工扩增DNA的方法，它通过特殊的引物和酶，在不断重复的三步反应过程中，从少量的种子DNA扩增成大量的目的序列DNA，扩增倍增数为2的n次方（n为PCR反应圈数）。
具体分为以下三步：1. DNA的变性：将DNA分子解旋成单链DNA，使其变性为单链状，并且使引物比较容易结合到目的位点上。
2. 引物的延长：当温度升高时，引物能够与DNA模板相互结合，并利用DNA聚合酶进行引物的延长，从而造成新的DNA分子。
3. 分子的复性：降温时，引物与延长的DNA形成复合体，使得两条单链相互结合成双链。
这三步反应可以被循环地重复进行，从而扩增出单一DNA分子，形成大量的DNA序列。
PCR技术的核心是引物，引物与待检测DNA的特异性是决定PCR检测灵敏度和特异性的关键因素。
PCR技术在疾病诊断中的应用PCR技术在病原微生物诊断中的应用在传统的临床实验室中，对于病原菌的分离和识别需要消耗大量时间和人力，而且有时会出现假阳性或假阴性的结果。
而PCR 技术的出现，则为病原微生物的诊断带来了一种快速、准确并且可靠的选择。
目前，PCR技术已广泛应用于包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等微生物的诊断中。
以细菌为例，临床医生在怀疑患者感染了某些细菌之后，可以采用PCR技术诊断。
如：PCR技术可用于诊断结核病，此时，核酸扩增的靶标为Mycobacterium tuberculosis，而且由于M. tuberculosis繁殖约短，所以PCR技术在结核病的早期诊断和治疗中，具有良好的疗效，也可以预测患病者敏感基因类型。
PCR技术在遗传疾病诊断中的应用PCR技术也广泛应用于遗传病的诊断中。
PCR原理及其操作高中
PCR原理及其操作高中PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA（脱氧核糖核酸）的方法，其原理是通过反复的循环变性、退火和延伸，可以产生数量巨大的目标DNA。
PCR的原理：1. 变性（Denaturation）：将待扩增的DNA模板加热至95℃，使DNA双链分离为两条单链。
2. 退火（Annealing）：将反应温度降至50-65℃，将两条单链DNA 通过引物（即特异性的寡核苷酸）与之结合，引物可以与目标 DNA 序列的两个端部序列互补，使引物与目标 DNA 产生连接。
3. 延伸（Extension/Elongation）：在72℃下引入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），该酶可以在单链DNA模板上合成补充链。
引物指导下，Taq聚合酶会合成目标DNA片段，其中甲基化的dATP会被酶识别的dATP 所取代，DNA聚合的速度为合成的DNA链的双链数量倍数。
PCR操作步骤：1.样品准备：将待扩增的DNA样品从细胞或组织中提取，除去可能存在的蛋白质、RNA等杂质。
2.准备PCR反应体系：将DNA样品与引物、酶、碱基、缓冲液和辅助试剂等混合，构建PCR反应细胞。
3.PCR循环反应：按照PCR步骤的原理，对PCR反应细胞进行循环变性、退火和延伸。
通常，PCR反应需要进行25-40个循环，每个循环的时间可以在几秒到几分钟之间。
4. 结果分析：使用凝胶电泳等方法将PCR产物进行分离和可视化。
通过与标准分子量 Marker 比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
PCR的应用：1.基因克隆：PCR扩增可以得到具有高度准确性序列的DNA片段，用作基因的克隆、定向突变、酶切及连接等。
2.基因诊断：PCR方法对检测和诊断具有临床意义的遗传病、感染性疾病、肿瘤等有非常重要的应用，例如HIV检测、癌基因检测等。
3.DNA定量：通过PCR反应的机理，可以根据PCR产物的量来估算初始目标DNA的含量。
4.DNA测序：在PCR反应中，可以通过添加分析位点的标记引物，对特定区域的DNA进行扩增并进行测序。
pcr的原理是什么
pcr的原理是什么
PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA（脱氧核糖核酸）的方法。
其原理基于DNA的双链结构和DNA聚合酶的酶活性。
PCR过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，通过加热，将目标DNA分子的双链融解为两条单链，
这一步被称为变性。
在高温下（通常为94-98°C），DNA双
链会解开成两条独立的单链DNA，使靶标序列可供引物结合。
接下来，降温使两个引物（寡核苷酸片段）与目标序列的两个互补区域结合，这一步被称为退火。
引物是针对目标序列的特定DNA片段设计的短链DNA序列，其中一个引物与目标序
列的前端相对应，另一个引物与目标序列的后端相对应。
在延伸步骤中，聚合酶开始从引物的3'端开始合成新的DNA 链。
聚合酶在延伸过程中依靠一个供体DNA链，把进入PCR
混合物中的DNA片段的互补序列合成出来。
这个过程循环进
行多次，每次循环都会产生两条新的DNA分子。
通过PCR，可以在短时间内从少量的DNA起始物扩增成数百
万个复制物。
这种方法在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用，包括基因分型、人类遗传学研究、病原体检测和DNA
测序等领域。
amos聚合酶链式反应
amos聚合酶链式反应
Amos聚合酶链式反应（Amplification of Multiple Targets for Nucleic Acid Sequencing）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，用于同时扩增多个靶标的核酸序列。
它可以在单个反应体系中同时扩增数十至数百个靶标序列，具有高度的多重并行性和高效性。
Amos聚合酶链式反应的原理与传统PCR类似，但是在反应过程中引入了多个引物对，每个引物对应一个靶标序列。
通过在PCR反应体系中添加多个引物对，可以同时扩增多个靶标序列。
Amos聚合酶链式反应的应用非常广泛，特别适用于高通量测序、基因组学研究、疾病诊断等领域。
它可以快速、准确地扩增多个靶标序列，可以有效地提高测序效率和准确性，同时节省时间和成本。
Amos聚合酶链式反应是一种高效的核酸扩增技术，可以同时扩增多个靶标序列，广泛应用于生物学研究和临床诊断中。
聚合酶链式反应原理和应用
聚合酶链式反应原理和应用
聚合酶链式反应原理是双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
聚合酶链式反应技术应用广泛，在很多领域都有应用，如：
1.分子生物学和基因组学：用于扩增特定的DNA片段，对目的基因进行体外
扩增和克隆。
2.临床和诊断：用于检测和鉴定DNA序列，进行基因突变分析、基因分型
等。
3.生物技术和基因工程：用于构建转基因动物和植物，进行基因敲除、基因
沉默等。
4.分子进化：用于研究DNA序列的进化关系，分析物种之间的亲缘关系。
5.医学和临床：用于检测和鉴定遗传性疾病的基因序列，进行产前诊断和基
因治疗等。
聚合酶链反应的原理和过程
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理和过程1. 引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR的原理基于DNA的复制过程，通过重复进行一系列的温度变化和酶催化反应，使得DNA模板序列得以扩增。
PCR技术的发展极大地促进了基因组学、遗传学、医学诊断和犯罪学等领域的研究。
2. PCR的基本原理PCR技术借助于DNA聚合酶这个酶来实现DNA片段的扩增。
其基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性首先，在高温条件下（通常为94-98摄氏度），将待扩增样品中的双链DNA解链成两条单链模板。
这一步被称为变性（Denaturation），其目的是打破氢键连接，使双链DNA分离成两条单链。
2.2 退火接下来，在较低温度（通常为50-65摄氏度），通过引入一组特异性的引物（即寡核苷酸引物，通常为20-30个碱基），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
这一步被称为退火（Annealing），其目的是将引物定位在待扩增的DNA序列上。
2.3 延伸最后，在适宜温度下（通常为72摄氏度），加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使其沿着引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
这一步被称为延伸（Extension）或扩增，其目的是合成与模板DNA相对应的新链。
通过重复进行上述三个步骤，PCR技术可以在相对短的时间内从少量起始DNA扩增出大量特定片段的DNA。
3. PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：3.1 DNA模板PCR反应需要待扩增的DNA片段作为模板。
模板可以是从细胞提取得到的基因组DNA、cDNA、质粒等。
3.2 引物PCR反应需要两条引物，分别位于待扩增序列的两端。
引物是由碱基组成的短链RNA或DNA分子，具有与待扩增序列互补的碱基序列。
引物的设计十分重要，需要确保其与待扩增序列的特异性结合，避免与其他非目标DNA结合。
pcr反应的原理及步骤
pcr反应的原理及步骤PCR（聚合酶链式反应）一种分子生物学技术，它利用酶的特定性质将少量的DNA序列扩增为大量的DNA序列，以便于后续研究。
PCR技术已经广泛应用于医学、生物学、法医学和环境科学等领域，成为生物分子研究中最重要的工具之一。
下面详细介绍PCR反应的原理及步骤。
一、PCR反应的原理PCR反应是指把少量的DNA模板扩增为大量DNA的技术。
该技术系多次复制小段DNA的过程，是一种体外的细胞复制技术。
PCR技术过程中主要包括三个重要的步骤：变性、引物与DNA复制。
在变性步骤，将DNA链分离成单链，使其能够与引物形成复合物，在引物的作用下，在DNA聚合酶的辅助下，进行合成反应，产生一个新的DNA链。
在PCR反应中，利用一种特殊的DNA聚合酶——Taq聚合酶。
由于Taq聚合酶稳定性高，耐高温和高盐浓度等多种条件下工作，使其成为PCR反应的首选酶之一。
PCR反应通常包括：预变性、变性、退变性、延伸和保持等步骤。
以下是详细的步骤介绍。
二、PCR反应的步骤（一）PCR反应的前期准备在进行PCR反应前，需要准备好以下的试剂和设备：1. DNA模板DNA模板是PCR反应的起点。
新鲜或保存时间较短的DNA更适合进行PCR反应，因为存放时间过长可能会导致DNA的降解。
2. 引物引物是指使用一对特定的寡核苷酸引物，用于聚合酶链反应的启动和反应的低温退火程序。
引物的设计对PCR反应的准确性、特异性和效率等方面起到关键作用。
3. dNTPsdNTPS是脱氧核苷酸三磷酸盐，是DNA链的合成所必需的单体，其中包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
通常采用等浓度的四种dNTPs。
4. 反应缓冲液反应缓冲液含有pH、离子和其他的成分，与聚合酶链反应的酶活性最佳条件一致。
（二）PCR反应的步骤1. 预变性（Pre-denaturation）在PCR反应之前进行预变性，使反应混合物中暴露的DNA链变性转变成单链状态，从而使引物在继续链扩增时能与模板DNA复合。
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
q-pcr的基本原理和应用
q-PCR的基本原理和应用1. 基本原理q-PCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链反应）是一种用于快速测定DNA或RNA中特定序列数量的技术。
它结合了PCR技术和荧光探针技术，通过荧光信号的增强和测量来确定目标序列的相对数量。
q-PCR的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA或RNA的提取和纯化：从样品中提取目标DNA或RNA，并经过纯化步骤以去除杂质。
2.逆转录（RT）或DNA扩增：将提取的RNA逆转录为cDNA（逆转录PCR）或直接扩增DNA（DNA PCR）。
3.荧光探针引物的设计：设计用于特定目标序列的引物和荧光探针，探针上带有荧光物质和一个与目标序列互补的DNA序列。
4.PCR扩增：将逆转录的cDNA或DNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行多轮的温度循环扩增。
每一轮循环包括DNA的解旋、引物与模板DNA的结合、DNA合成。
5.荧光信号的检测：在每一轮循环中，荧光探针与目标序列特异性结合，荧光信号量增加。
荧光信号在每一轮循环后进行检测和记录。
6.数据分析：通过测定荧光信号的增加速率和信号量来确定目标序列的相对数量。
根据荧光信号的阈值周期数（Ct值），计算目标序列的表达量或拷贝数。
2. 应用q-PCR在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：•基因表达分析：q-PCR可以 quant化目标基因在不同样本或条件下的表达水平，用于研究基因调控、细胞分化和发育等生物学过程。
•病原体检测：q-PCR可以快速、准确地检测和诊断病原体感染，如病毒、细菌和真菌等。
通过检测特定基因序列的存在与否，可以确定样品中是否存在病原体。
•肿瘤检测和诊断：q-PCR可以检测肿瘤相关基因的突变和表达水平变化，用于肿瘤的早期筛查、诊断、预后评估和治疗监测。
•遗传疾病诊断：q-PCR可用于检测遗传疾病相关基因的突变或拷贝数变异。
通过定量分析目标序列的拷贝数，可以确定遗传疾病的诊断和携带状态。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
检测电泳结果
观察电泳结果，通过染色或荧光染料标记的方法检测PCR产物的位 置和大小，判断是否成功扩增出目标片段。
04
结果分析
电泳结果解读
01
电泳条带的亮度与产物量
电泳条带的亮度通常与产物量成正比。如果观察到某一泳道的条带亮度
显著高于或低于其他泳道，可能表明该泳道的PCR产物量存在异常。
感谢观看
THANKS
例混合，配置成PCR反应液。
设定PCR程序
根据所使用的DNA聚合酶和PCR 仪器的要求，设定PCR扩增程序， 包括变性、退火、延伸等温度设置 以及循环次数等。
进行PCR扩增
将PCR反应液放入PCR仪器中，按 照设定的程序进行扩增反应。
电泳检测
配置电泳液
选择适当的电泳缓冲液和染料，配置成电泳液。
进行电泳
移液器
精确移取一定量的溶液，进行 实验操作。
电泳仪和电泳槽
用于检测PCR产物，通过电泳 观察扩增结果。
实验试剂准备
01
02
03
缓冲液
提供PCR反应所需的缓冲 环境，维持反应体系的酸 碱度和离子浓度。
去离子水
稀释和配制溶液所需的水 源。
染料
用于电泳时染色DNA片段， 便于观察和检测。
03
实验步骤
模板DNA的制备
定量分析
通过测量PCR产物在特定波长下的吸光度，可以定量分析 产物量。常用的定量方法包括终点法、动力学法和标准曲 线法。
重复性评估
为了确保实验结果的可靠性，需要评估不同实验条件下 （如不同PCR循环数）的重复性。这可以通过计算重复实 验之间的变异系数来实现。
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PCR-VNTR
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生物芯片技术
九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术， 引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种 微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载 体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析 单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细 胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列 阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过 与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸 序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因， 实现生物基因信息的大规模检测。
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3、多重PCR
在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果 这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的 区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增 多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子 的缺失，或在检测缺失设置内对照。
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4.RT-PCR
RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作 用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平） 迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高 mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与 调控的研究。
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过 程
PCR-SSCP过程：
原 理
DAN
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 4 自显影 ↓ 结果分析
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2. 巢式PCR（nest PCR）
此时也是进行二步PCR，与上面不同的 是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应 用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初 级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板， 进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异 的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提 高了最终产物的特异ction,PCR）
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚 合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技 术。 体外程序化的DNA合成技术。
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PCR
2
原
理：
1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补 的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片 段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶， buffer 3）反应程序： 变性94~95oC 复性 延伸 37~55 oC 70~72 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍
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DNA分析中常用的多态性标记有3类：
1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一 代多态性标记； 2）重复序列多态性：短串联重复序列 （STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核 苷酸的差别，为第三代多态性标记。
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一、序列多态（或点多态）
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或 新的酶切点出现，从而引起不同个体的 DNA在用同 一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种 由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为 RFLP。 RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有 用的遗传标记。
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Allele II 产生了新的酶切点
12Kb
Allele I
8Kb 4Kb
12Kb 8Kb
Allele II probe
RFLP—Southern blot检测结果
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AlleleII酶切位点消失
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二、序列长度多态性（或数目变异串联重复， variable number tendom repeats, VNTR） 重复序列以各自的核心序列（重复单元）， 首尾相连多次重复，称为串联重复序列。 散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式 形成多态。如图： VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之 间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不 同长度的片段。
.
解链 构像
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1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
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第二节
DNA多态
DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA 是不完全相同的，一般每100～500bp就有一 个是不相同的，它们多位于内含子序列中， 表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常 用做遗传分析中的标记。 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA 是完全相同的。
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RT-PCR
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RT-PCR
cDNA
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五、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）
是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差 异，这种差异将造成相同或相近长度的单链 DNA 电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基 的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行 PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯 酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的 DNA 构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出 判断。
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VNTR 酶切，电泳后的检测结果
大
小
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PCR-VNTR检测
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通常，重复单位16～28bp长，称为小 卫星DNA。 重复单位２～6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。 DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检 出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, AmpFLP）
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PCR扩增
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PCR特点及应用：
特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速； 2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
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PCR相关技术：
1.增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两 个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增， 消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对 于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的 引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物 二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增， 只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后 补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增， 靶序列的产量将相应增加。