寡核苷酸介导的定点诱变ppt课件

在dut+的E. coli中
dUTP酶
dUTP
dUMP
在dUTP 酶缺失体中（dut- ）
dUMP dUTP
dut：dUTPase突变，可导致E.colidUTP 的量增加，当DNA复制时，可在很多应 该加dTTP的位置加入dUTP。
+ 在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基 化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的 尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中， 此酶失活。
+
限制酶位点消除法的操作步骤是：①将带突变碱基的寡核苷
酸引物与重组体单链模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复
制，产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA；②用特定的限制酶在
此异源双链DNA上作切口，此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而
被切开，而新合成的子代链则无法切割；③使用核酸外切酶将亲代模
板链全部水解去除，然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板，
利用一段含有突变序列的 寡核苷酸片段作为引物，经 DNA复制过程合成靶DNA片段， 使其子代链发生突变，称为引 物诱变。
引物诱变的基本操作步骤： ①获得单链目的基因；②人工 合成带突变序列的引物；③制 备异源双链DNA；④转染宿主 细胞；⑤筛选重组体；⑥突变 基因的鉴定和回收
Kunkel诱变法（The
点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
快速引物诱变
（QuikChange Primer Mutagenesis）
这是由Stratagene公 司开发的一种引物定点诱 变法，该法的操作步骤如 下：①将带目的基因的重 组体在dam+菌株中扩增， 使DNA序列被dam甲基化 酶所修饰；②使用带突变 碱基的寡核苷酸引物，在 较高温度下复制子代链， 形成双链突变体；③用限 制酶DpnⅠ将带甲基化标记 的亲代双链水解；④将突 变体转化宿主细胞
+ 限制酶位点消除引物诱变（Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination）
+
限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由
硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的DNA片段的特性，去除
不含突变碱基的亲代模板链，以提高定点突变效率的技术方法。
经二次复制合成双链
Kunkel Mutagenesis Method）
这是1985年由Kunkel等人建 立的一种寡核苷酸引物诱变法， 该法的操作步骤如下：①将复制 型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷 三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺 陷的E. coli（dut-，ung-）菌株中 生长，使U取代T掺入到DNA链中 （一般每个重组体20~30个）；② 以此种带U的DNA链为模板，用带 突变碱基的寡核苷酸引物进行复 制，产生异源双链；③将此异源 双链转化到ung+菌株中生长，含 U的模板链被破坏，从而使子代 DNA链大部分（~80%）含突变碱 基序列
+
在大肠杆菌dut- ung-菌株
中生长的M13噬菌体的单链基因组
DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。
用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧
啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，
感染力下降约5个数量级。
+
此法的成功关键，是要得到好
的含Ｕ单链模板DNA。
+
Baidu Nhomakorabea这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位
+ 盒式诱变（Cassette Mutagenesis）
+ 利用一段人工合 成的含有突变序列的 寡核苷酸片段，取代 野生型基因中的相应 序列，从而达到定点 突变的目的，称为盒 式诱变。实施盒式诱 变时，要求靶DNA插 入点两侧有合适的限 制酶单一切点（图 4~5）。
盒式诱变的例子
引物诱变（Primer Mutagenesis）