第二章基因工程制药part2.pptx
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基因工程制药新版(2)ppt课件
（二）关于限制酶
1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在 宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限
制 （restriction）与修饰(modification) ,简
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化
的序列。
甲基化酶
ECOB核酸酶
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
CH3 TGAN8TGCT ACTN8ACGA CH3 CH3 CH3
噬菌体来源序列
宿主来源序列
R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
பைடு நூலகம்
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于
称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降 解掉。
R/M体系： 是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有 EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。
3、限制酶的特征
具有专一性的识别 位点。
能够形成固定的核 苷酸单链末端。 比较适合于进行 DNA结构的分析 和进行基因重组。
第二章基因工程制药part2
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
第二章 基因工程制药.ppt
2019-10-13
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五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析：
是以离子交换剂为固定相， 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本，提高产品质量。
2019-10-13
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二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
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2019-10-13
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1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3．费用较高
2019-10-13
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V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻，保护自身的过程。
2019-10-13
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Vitamin A
2019-10-13
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第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
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一、反转录法
1．mRNA的纯化
（1）选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
（2）分离总RNA。 （3）分离mRNA（多聚T纤维素）
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
第二章-基因工程制药_PPT幻灯片
传统生物药物由于来源及制备上的困难、价 格等因素的影响，此外在制备过程可能受到 的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工 程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的 优势。
应用基因工程技术可十分方便且有效地解决 上述提到的问题，从量、质上都可以得到改 进，且可以创造的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体 内能表达产生所要蛋白产物。
生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于 细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA 分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所 需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出 40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的 基因的方法是人工合成，即基因模版合成。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒
构建基因工程 菌或细胞
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成；
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2、cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为 引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP；在 凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小， 探索最佳反应条件。
3、cDNA第二链的合成
先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交 链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二 链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形 结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此 反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性 切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结 构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖 凝胶电泳进行测定。
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共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度 有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在 翻译过程中发生中止和移码突变。
解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密
码子。 在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆
在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理 因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶 活力往往能达到比较高的水平。
提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
表达质粒的优化和设计
在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征 和特点，注意引入翻译增强子序列
能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻 译增强子。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 IIe 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
蛋白质水解酶的特点
细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在 细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。
通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计 学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白 质降解，稳定性较差。
菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。
核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。
尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱 基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。
共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
现在还没有一个有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。
由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
高效表达目标基因的战略和技术
表达质粒的优化和设计 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA基因 提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性 高密度发酵和工程化宿主细胞
表达质粒的优化和设计
在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
表达质粒的优化和设计
在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术 改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5‘端的“茎环”结 构。
把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身 的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因， 一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’ 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形 下。
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始 密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适 当的范围。
核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有 显著影响，
表达质粒的优化和设计
具体表现为： SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要 表现为： • 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
一般比较低，不能满足大规模制备的需要。 • 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
慢，使高密度发酵比较困难。 • 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
生物比活力降低，甚至没有活性。 • 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离 去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。 • 对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数 据，而目前这方面的数据库还不完整。
倍。 翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8
个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。 ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与
AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。 ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
表达质粒的优化和设计