实验一至三__芦丁提取纯化及分析2014-修正终版

实验名称指导教师

实验1 芦丁的提取及水解制备槲皮素周延

实验2 高效液相色谱法芦丁及槲皮素标准曲线的测定周延

实验3 芦丁的大孔吸附树脂纯化梁浩

13-4人一组，每批9组（4个班学委自己协调分批，如有事，可与其他班同学调换。数据汇总到药1学委处，下周五7月4日前药1学委把每批的名单发我）以小组为单位进行实验。

2实验二分为2部分，实验二-1为标准曲线制作，实验二-2为样品测定。两次实验必须使用同一台色谱仪，否则实验结果无效。

3每组带洗净的250ml空饮料瓶1个。

4工艺实验教师起辅助作用，同学根据参考资料自己完成实验。提前预习关键点，设计实验记录表格，会检查预习笔记。实验1的条件为建议条件，可根据查阅文献，进行条件修改（报告中需说明理由和文献依据）。

5实验后原始记录需进行登记，收拾好老师检查后方可离开。

63个实验分别写报告，每个人的三份订在一起。完成实验后一起以班为单位尽早上交。最迟请于7月19日上午9点前交到制药工程办公室科西310。

实验一芦丁的提取及水解制备槲皮素

一、实验目的和要求

通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

通过测定芦丁和槲皮素含量巩固色谱仪使用方法。

二、实验原理

（一）概述

芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。芦丁有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。

芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。芦丁在酸性条件下可水解得到槲皮素。

利用芦丁易溶于碱性水，难溶于酸性水，可用碱性水提取，再调至酸性，黄酮苷（芦丁）即可沉淀析出。提取过程中为了防止芦丁氧化可加入焦亚硫酸钠抗氧化，并加入硼砂保护邻二酚羟基不被破坏。得到粗芦丁后利用其可溶于热水、难溶于冷水的性质重结晶进行精制。

三、仪器和试剂

1实验设备与仪器

烧瓶，温度计，布氏漏斗，抽滤瓶，循环真空泵，恒温加热及磁力搅拌装置，试管，量筒，烧杯，干燥箱，冷凝管，HPLC

2实验材料与试剂

槐花米，硼砂，焦亚硫酸钠，氧化钙，无水乙醇，甲醇，硫酸，盐酸，精确pH试纸，

四、实验内容

1 芦丁的提取

（1）将80g槐米，500mL（pH8-9）澄清石灰水，1.2g硼砂，2.4g焦亚硫酸钠一起置于1000mL圆底烧瓶中，65℃搅拌提取55min，注意添加蒸馏水及烧瓶中颜色的变化（深棕黄色），趁热过滤。

（2）滤下的槐米再次加入400mL澄清石灰水，0.9g硼砂和1.8g焦亚硫酸钠，65℃搅拌提取50min，趁热过滤。

（3）合并两次滤液，用浓HCl调pH至4，置于冰箱中。

2 芦丁的精制

（1）粗芦丁沉淀过滤后干燥，取2g加入400mL蒸馏水，煮沸至芦丁全部溶解，趁热过滤，滤液置冰箱中冷却即可析出结晶，抽滤得芦丁精制品。

3 芦丁的水解（选做）

取精制后的芦丁1g，研碎后于250mL烧瓶中，加2%硫酸溶液80mL，小火回流60min。开始加热10min为澄清溶液，逐渐析出黄色针状结晶，即槲皮素，抽滤并用蒸馏水快速洗涤晶体。

4 分别测定粗芦丁、精制芦丁和槲皮素固体的纯度

五、数据处理

1 根据标准曲线计算产品纯度。

2 计算每步收率

六、思考题

利用你学过的知识如何确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上？

怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖？

实验二高效液相色谱法芦丁及槲皮素标准曲线的测定一、目的和要求

1学习高效液相色谱仪的操作。

2了解液相色谱法分离的基本原理和色谱仪组成。

3掌握用液相色谱的定性和外标法定量的方法。

二、原理

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是20世纪60年代末70年代初迅速发展起来的分离分析技术，它适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的天然的高分子化合物等。

高效液相色谱由两相——固定相和流动相组成，它的固定相可以是吸附剂、化学缝合固定相(或在惰性担体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶，流动相则是各种溶剂。根据固定相的类型和分离机制，高效液相色谱可分为：液—固吸附色谱、液—液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。我们常用的为液—固吸附色谱。

根据流动相和固定相极性的相对强弱，液固色谱又分为正相色谱和反相色谱。正相色谱以亲水性的填料作固定相（如在硅胶上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相），以疏水性溶剂或混合物作流动相（如己烷），侍分离物质主要靠极性作用结合在固定相上，洗脱时极性弱的物质先被洗下。反相色谱以强疏水性的填料作固定相（如在硅胶上键合C8或C18烷基的固定相），以可与水混溶的有机溶剂做流动相（如甲醇或乙腈），侍分离物质主要靠非极性作用结合在固定相上，洗脱时极性强的物质先被洗下。

（一）高效液相色谱的常用术语和重要参数

色谱图反映出被色谱分离的各组分从色谱柱中洗脱出的浓度变化情况。通常横坐标代表洗脱时间，它与流过色谱柱的流动相体积成正比，纵坐标代表检测器检测信号的大小，通常与组分的浓度成正比。图1是一个典型的色谱洗脱曲线。

图1 典型色谱洗脱曲线