第3章 动物细胞工程制药(二)

巨 载 体 反 应 系 统
比 欧 P 型 中 试 生 物 反 应 器
第七节 动物细胞生物反应器
二、动物细胞生物反应器的检测控制系统
•
检测参数的全面性和控制系统的精确性反映了生物反应器 的水平。
1. 培养过程中需检测的物化参数 可直接在线经传感器检出的：温度、pH、搅拌速 度、溶氧等； 需要取样离线检测的：活细胞数、氨基酸浓度分 析、葡萄糖、乳酸和氨离子的测定； 检测后需计算才能获得的：细胞的群体倍增时间、 细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生 物反应器生产率等。
︵细 贴胞 壁转 培瓶 养 培 ︶ 养器
3.
贴壁—悬浮培养（假悬浮培养） 将悬浮培养和贴壁培养二者结合起来，优势互补， 形成的一种更理想、更适于工业化大规模生产的培养方 法。
（1）微载体培养（microcarier culture) （2）包埋和微囊培养 （3）结团培养
（1）微载体培养
• 微载体培养是以细小的颗粒作为细胞载体，通过 搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成 单层的一种细胞培养技术。 • 优点：兼具悬浮培养和贴壁培养的一切优点，放 大容易，应用广泛。 • 微载体是指直径在60-250μ m，能适用于贴壁细胞 生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成 的聚合物组成。目前国际市场上出售的微载体商 品类型已达十几种以上。例如液体微载体、大孔 明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲 壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微 载体以及磁性微载体 。常用的微载体基质包括葡 聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类等等。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作的基础上，每间隔一段时间，不 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新的营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期进行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高的水平。
2. 主要参数的检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应的转速计） （5）进出液流量（泵速的控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
膜生物反应器
膜 生 物 反 பைடு நூலகம் 器 膜 片
中空纤维膜细胞培养系统
5.固定床或流化床式生物反应器
• 结构比较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有 利于细胞贴附的材料，如不锈钢、玻璃环、玻璃球、光面 陶瓷、塑料等实心的载体；也可以是有孔的陶瓷、有孔的 玻璃、有孔的聚氨酰酯塑料等。
• 以上所述的只是许多生物反应器中的一部分，其他如蜂窝 状陶质制备的生物反应器， Bellco公司生产的可同时制 备巨载体的生物反应器等也都各有其特点。
气升式生物反应器
3.中空纤维生物反应器
• 该反应器模拟了机体内毛细血管系统，是由数百乃至数千 根中空纤维集束组成。 • 一般来说，中空纤维是用聚矾或丙烯的聚合物制成。管壁 的厚度约50～75μ m，直径为200μ m，呈多孔性，内层为 起滤膜。 • 中空纤维细胞培养反应器既可培养悬浮生长的细胞,又可 培养贴壁依赖性细胞，细胞密度高达108个／cm2。如果能 控制系统不受污染，则能长期运转，细胞可保持较高的存 活性、健康的形态和核型，具有很高的工业应用价值。
第八节 动物细胞产品的纯化方法和 质量要求
• 细胞培养物的纯化工作难度大，因为：
①工程细胞表达的产品，常常细胞内容物、培养基成分混 杂在一起，而这些成分的物化性质又常常和目的产物非常 相似，难以将它们分离开。
②由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，
因此对产品的纯度要求很高（98%以上）。 ③大多数动物细胞表达的产物产量低、生物活性很不稳定， 因此要求纯化过程中所有操作都应该非常温和、精细，这 就需要相当精密的设备和检测仪器，增加了纯化难度。 ④由于细胞产品多种多样，因此分离纯化技术的通用性差。
1. 悬浮培养（suspension culture)：让细胞自由地 悬浮于培养基内生长增殖。
它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也 适用于兼性贴壁细胞。 ◆优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好， 容易扩大培养规模，可借鉴许多有关细菌发酵的经验。 ◆不足：较难采用灌流培养，细胞密度一般较低。 目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐生物 反应器和气升式生物反应器。
（2）包埋和微囊培养
• 包埋培养是将细胞包埋或包裹在凝胶载体内或微 囊内进行培养的一种技术，有时又称之为巨载体 （macrocarrier)培养. • 微囊培养由包埋培养衍生而来，即将包埋的颗粒 经液化处理而成为微囊。 • 可用于包埋细胞的载体材料大致有3类： ①人工合成的高分子聚全物； ②糖类，如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、 海藻酸钙、脱乙酰几丁质等； ③蛋白质，如胶原、明胶、纤维蛋白等。 • 微囊膜的制备则通常采用海藻酸钠—聚赖氨酸系 统。
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
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① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
• 动物细胞生物反应器，是给动物细胞的生长代谢 提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过 程中产生出最大量、最优质的所需产物。 • 理想的动物细胞生物反应器必须具备的基本要求 （P107）。 • 各种动物细胞生物反应器，按其规模大小，一般 将其分为实验室规模， 中试规模和生产规模。
第七节 动物细胞生物反应器
（3）结团培养
用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的 方法进行培养的一种细胞贴附—悬浮培养技术。 在实际使用中，为了加速细胞的结团，可先在培 养基内加入一些直径较小的微粒（20μ m）。此法 与微载体培养的不同是：用量小，细胞不能在载 体上伸展，细胞呈球形。 该培养方法的优点：操作简便，节省了用于微载 体的成本。
理想的微载体需具备的一些条件：
微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸 展和增殖。 微载体的材料无毒性。 微载体的材料是惰性的。 微载体的比重为1.030～1.045g/ml，在低速搅拌下就可悬浮， 而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获。 粒径在60 ～250μm之间，并要尽可能地均一，有利于细胞 均匀地分布于其表面。 具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察。 基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体互相摩擦 而损伤细胞 可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌 经简单的适当处理后，可反复使用。 原料充分，制作简便，价廉。
• 此类反应器的特点是气体通过装在罐底的喷管进入反应器 的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体密 度，而使液体形成循环流。一般有两种构型，内循环式和 外循环式。 • 优点：剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，有利于 设备的密封，降低了造价。 • 该反应器主要用于悬浮细胞的分批式培养，近来也被开发 用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流 培养。
• 灌流式操作在某些生物反应器是唯一可行的操作 方式，如中空纤维生物反应器、固定床或流化床 反应器、膜式生物反应器等。 • 但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中进行灌 流式操作，就存在一个使条件培养基和细胞、载 体分离的问题。——滤网、中空纤维分离、超声 波分离器、排液柱、专用离心机等
第七节 动物细胞生物反应器
一、动物细胞生物反应器的类型及基本
结构
• 随着动物细胞大量培养技术的发展，新型的生 物反应器正在不断出现。 搅拌罐式生物反应器 气升式生物反应器 中空纤维式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器 固定床或流化床式生物反应器 其它新开发的生物反应器。
1. 2. 3. 4. 5. 6.
1.搅拌罐式生物反应器
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面新 鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应液连 续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种不断的营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
• 搅拌罐式生物反应器是最经典的和最早被采用的一种动物 细胞反应器，为改造成更适于动物细胞的培养——搅拌器 转动时产生的剪切力小、混合性能好，主要进行了几方面 改造（P108）。 • 搅拌罐式生物反应器主要用于悬浮细胞的培养、微载体培 养、微囊和巨载体培养以及结团培养。
搅拌式细胞培养反应器
2.气升式生物反应器
中空 纤维 管
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优点：占地空间小，产品产量、质量高，生产 成本低。 不足： ①不能重复使用。 ②不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其他 消毒剂灭菌。 ③难以取样检测。 平床式中空纤维生物反应器的核心是中空纤维 反应室。
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4.透析袋或膜式生物反应器
• 透析袋或膜式生物反应器，可将动物细胞培养过 程中所产生的代谢产物透析或过滤掉，从而使细 胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相 对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分 离开。 • 此类反应器既可用以培养贴壁细胞，也可培养悬 浮细胞。 • 优点是：既可使细胞达到很高密度（细胞室内达 108个／ml），又可随意组合进行操作，达到保留 和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的。
悬浮 培养