冬枣果酒酿造酵母的分离筛选研究
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酵母菌发酵速率测试：采用CO2失重比较法。将分离 初筛的酵母菌分别接于麦芽汁液体培养基，28℃、130r/min摇 床培养24h。分别吸取上述菌液，按5%接种量加入冬枣汁 发酵培养基中，28℃静置发酵，每隔12h称量一次，并记录 其重量的变化，筛选出发酵力好的菌株。
酵母菌耐酒精性、耐糖测试：采用杜氏管发酵法，将酵 母 菌 分 别 接 入 不 同 乙 醇 浓 度 （6%vol、8%vol、10%vol、 12%vol）和不同糖度（12°Bx、15°Bx、18°Bx、21°Bx、25°Bx） 的冬枣汁中，置于28℃培养箱静置培养48h，观察杜氏管中 的气泡产生情况，比较各酵母菌株对乙醇、糖的耐受程度， 进一步确定适合冬枣酒酿造的菌株，试验平行重复3次。
生化鉴定糖类：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、 棉籽糖，纤维二糖、肌醇、核糖、赤藓糖醇、鼠李糖、木糖、核 糖醇、柠檬酸、琥珀酸、甘露醇、可溶性淀粉、阿拉伯糖、海 藻糖，硝酸钾均为分析纯。 1.4 试验方法 1.4.1 酵母菌的增殖培养
取采摘于果园的成熟冬枣，直接榨汁后自然发酵，当 发酵瓶中有大量气泡产生时，取发酵醪10mL接入90mL酵 母富集培养基中，于28℃培养20h~24h。 1.4.2 酵母菌的分离、纯化、保存
取富集培养液按梯度稀释法，涂布于麦芽汁琼脂培养 基平板，每一梯度做3个平行，于28℃培养48h，挑取具有典 型酵母菌落形态的菌落，分别在麦芽汁琼脂培养基平板上 进行划线分离纯化培养，直至有单菌落出现，镜检观察， 选 出 单 菌 落 ，转 接 至 麦 芽 汁 斜 面 试 管 上 ，28 ℃ 培 养 20h~ 24h，于0℃~4℃冰箱中保藏，备用。按此方法分离得到88株 酵母菌，依次编号为1#~88#。 1.4.3 酵母菌的筛选及性能测试
关 键 词：冬枣；酵母菌；果酒；筛选
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）08-004来自百度文库-04
Isolation and screening of Saccharomyces cerevisae from jujube wine
ZHANG Chenyun, LIU Jinfu, WANG Na, WANG Bujiang
1.4.4 酵母细胞数测定 采用 Neubauer 血球计数板法计数。25×16型血球计数
板的计算公式：
菌细胞数（mL）=
80×小格内菌细胞数 80
×400×10000×稀倍数
1.4.5 冬枣酒发酵试验 （1）工艺流程
冬枣→去杂→清洗→破碎→榨汁→酶解→过滤→调糖，调 pH 值→ 巴氏杀菌→接种酵母→发酵→陈酿→装瓶→杀菌→成品
冬枣营养丰富，含 有 19 种 人 体 氨 基 酸 ，VC 含 量 为 352mg/100g，被称为“活维生素丸”。冬枣采后常温下货架 期极短，大约1周开始失水、腐烂、褐变，丧失食用价值；低 温条件下贮藏冬枣果实，后期则发生腐烂、酒软、褐变，这 些都严重制约着冬枣产业的发展[1-3]。随着冬枣产量的迅速 增加，除了贮藏保鲜供应人们鲜食外，对冬枣进行深加工， 不断提高附加值，是 保 证 我 国 冬 枣 产 业 持 续 健 康 发展的 必然途径。冬枣果酒的酿造是以冬枣果汁为原料，通 过 优 良 酵 母 菌 种 进 行 发 酵 而成的低度饮料酒。在果酒酿造 中，酵母菌是发酵的原动力，优良的生产菌种是决定果酒 品质的关键。目前工业上用于果酒酿造的酵母多为葡萄酒 酵母，其是针对葡萄及葡萄酒生产工艺的特点开发出来的， 而葡萄与冬枣果汁的成分及酿造环境差别很大，用葡萄酒 酵母酿造冬枣果酒会产生所酿果酒口味欠佳的问题。张新 明 等 [4]采 用 鲜 枣 榨 汁 添 加 安 琪 酿 酒 活 性 干 酵 母 发 酵 ； 王颉等[5-6]将红枣、甘肃临泽小枣浸提，使用葡萄酒活性干 酵母发酵；赵静等[7]采用鲜冬枣浸泡在小曲酒制成冬枣果 酒；杨幼慧等[8]是应用葡萄酒酵母发酵发酵荔枝酒。可见， 在我国专用型果酒发酵菌种的研究与应用还很薄弱。
为适应果酒市场生产的需要，积极地从自然界含菌 材料中，筛选优良酵母菌种的研究工作具有重要意义。根 据冬枣果实含糖 量 高 和 含 酸 量 相 对 比 较 低 的 特性，本试 验筛选耐糖性和耐酒精性强的天然酵母菌。
1 材料与方法 1.1 原料及试剂
冬枣：采自于天津市静海冬枣果园。 对照菌株（CK）：法国F-15#葡萄酒活性干酵母。 1.2 仪器设备 HZQ-Q型全温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限 公司；HR1707型飞利浦搅拌机：珠海飞利浦家庭电器有限 公司；HBYQ电热恒温培养箱：天津市华北实验仪器有限 公司；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申 安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型净化工作台：苏州净化设备有 限公；OLYMPUS BX-41生物显微镜；WY型手持糖量仪： 成都万辰光学仪器厂；冰箱；生物实验室常用设备等。 1.3 培养基 1.3.1 酵母菌分离纯化培养基 斜面及平板培养基：麦芽汁琼脂培养基[9]。 种子培养基：麦芽汁液体培养基。 富集培养基：葡萄糖5%，磷酸二氢钾 0.25%，尿素0.1%， 酵母膏0.05%，硫酸镁0.1%，硫酸铁0.01%，孟加拉红（1%的 水溶液）0.023 %，于 121℃高压灭菌15min。 1.3.2 冬枣汁发酵培养基 经成分调整的冬枣原汁，于115℃高压蒸气15min间歇 灭菌2次。 1.3.3 酵母菌鉴定培养基[10]
（2）成品的感官检验 主要包括对酒体的色、香、味的评价，采用嗜好性感官 评定法。用葡萄酒活性干酵母作对照。 1.4.6 酵母菌的鉴定 酵母鉴定方法参考文献[11-13]。 酵母菌形态与培养特征观察：将分离菌种接种到麦 芽汁液体培养基中，28℃恒温培养3d~7d，观察培养液的浑 浊情况，是否形成环或岛，沉淀量多少以及紧密程度，采用 美兰染色水浸法制片，于显微镜下观察细胞形态，出芽方 式，死活细胞鉴定；同时将分离得到的酵母菌划线接种在 麦芽汁琼脂培养基平板上，28℃恒温培养2d~ 3d，观察其 菌落形态特征。 酵母假菌丝的观察：将菌株活化后，接种于玉米淀粉 琼脂培养基平板上，在平板上划线接种（每个板2~3条）， 在菌线上盖上无菌盖玻片，在28℃培养5d~10d观察。 酵母菌子囊抱子的观察：在接种到生抱培养基之前，将 菌株在麦芽汁培养基上，28℃重新培养1d~2d，进行活化， 将已活化好的酵母在产抱子培养基斜面上划线，28℃培养 3d，镜检是否有子囊孢子（子囊孢子绿色，营养细胞红色）。 未见孢子的在17℃左右保持4~6周，每周再检查是否出现 子囊孢子。注意观察子囊形前是否有接合现象，子囊与子 囊孢子的形状，每一子囊内孢子的数目。 发酵糖类试验：鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、麦芽糖、 半乳糖、乳糖和蔗糖。将一定量的糖分别加入到含有杜氏 发酵管的生理生化培养基中。酵母菌经活化后分别接入 到上述培养基中，28℃条件下培养，每隔2d观察发酵情况， 连续观察2周，每次观察时注意杜氏小管中CO2的量，以及 出现的速度，判断发酵情况。以杜试管中有气泡计为阳性， 无气泡为阴性。重复3次。 （5）同化碳源试验：鉴定所需同化物质共16种，为半乳 糖、棉籽糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、D-木糖、D-甘露糖 醇、纤维二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、柠檬 酸、乳糖、L-鼠李糖和肌醇。将一定量的糖分别加入到含有 杜氏发酵管的氮源基础培养基中，以含YNB而不含碳源的 试管作为不生长的空白对照。酵母菌经活化后分别接入 到上述培养基中，28℃条件下培养分别在第1、2和第3周观 察，以试管中出现混浊计为阳性，否则计为阴性。重复3次，
为获得一株或几株各种性能良好，且适于酿造不同类 型冬枣酒的酵母菌，对分离的酵母菌株进行进一步筛选。
酵母菌的初筛选：采用杜氏管发酵法。在28℃条件下， 测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气泡的多 少（以48h为标准），初步比较各株酵母菌的起酵能力和发 酵能力，试验平行重复3次。
酵母菌的复筛选：将经过初筛选出的菌株进行发酵 速率、耐酒精性、耐糖性试验。
产子囊抱子培养基：酵母膏0.3%，麦芽汁0.3%，蛋白 陈0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%，于121℃灭菌20min。
生理生化基础培养基：（1）氮源基础培养基：酵母膏 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.1%，（NH4）2SO4 0.5%； （2）碳源基础培养基：葡萄糖1%，KH2PO4 0.1%，酵母膏 0.1%，MgSO·4 7H2O 0.05%。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 8 期
总第 221 期 ·43·
冬枣果酒酿造酵母的分离筛选研究
张陈云，刘金福，王 娜，王步江
（天津农学院 食品科学系，天津 300384）
摘 要：对冬枣表皮和自然发酵的冬枣汁中的野生酵母菌进行了筛选。经过菌种富集培养和多次平板稀释分离培养、划线分离纯化 培养得到88株菌，采用杜氏管发酵法，CO2失重比较法等从中筛选出一株能耐受12%vol酒精和25°Bx糖度，发酵性能优良的酵母菌株 命名为TN9#，经初步鉴定TN9#菌株属于酵母属的酿酒酵母，可作为冬枣酒发酵专用菌种或冬枣果酒专用菌种选育的出发菌株。
收稿日期：2010-05-25 基金项目：天津农学院科学发展基金计划（2006002） 作者简介：张陈云（1979-），女，实验师，主要从事食品加工、食品发酵工程技术研究工作。
2010 No．8
·44· Serial No．221
China Brewing
Research Report
玉米粉琼脂培养基：将12.5g黄玉米粉溶于300mL水中， 搅 匀，以60℃热水预保温1h，用滤纸过滤，滤液加水至 300mL，加琼脂3.8g，121℃灭菌15min。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 8 期
总第 221 期 ·45·
以不加糖的培养基为对照。 （6）同化氮源试验：以硝酸钾为唯一氮源。方法参照
同化碳源试验。 2 结果与分析 2.1 酵母菌初筛
采用杜氏管发酵法对分离出的88株出发菌株进行初 筛。杜氏管发酵试验结果见表1。
发酵时间/h 10 16 24 48
(Department of Food Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
Abstract：In order to obtain optimal yeast for jujube wine making, wild yeast was screened from jujube surface and natural fermented jujube juice. Eighty-eight yeast strains were isolated by enrichment culture, dilution-plate and streak-plate purification. One yeast strain named as TN9#, which could grow under 12% alcohol and 25°Bx (sugar content) with superior fermentation capability, was selected by Durham tube test and CO2 weight loss. TN9# was preliminarily identified as Saccharomyces cerevisiae, and could directly serve for jujube wine making or act as the original strain for breeding of new strains. Key words：jujube; yeast; fruit wine; screening
表1 杜氏小管产气结果 Table 1. Results of Durham tube test
产气情况 + ++
酵母菌耐酒精性、耐糖测试：采用杜氏管发酵法，将酵 母 菌 分 别 接 入 不 同 乙 醇 浓 度 （6%vol、8%vol、10%vol、 12%vol）和不同糖度（12°Bx、15°Bx、18°Bx、21°Bx、25°Bx） 的冬枣汁中，置于28℃培养箱静置培养48h，观察杜氏管中 的气泡产生情况，比较各酵母菌株对乙醇、糖的耐受程度， 进一步确定适合冬枣酒酿造的菌株，试验平行重复3次。
生化鉴定糖类：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、 棉籽糖，纤维二糖、肌醇、核糖、赤藓糖醇、鼠李糖、木糖、核 糖醇、柠檬酸、琥珀酸、甘露醇、可溶性淀粉、阿拉伯糖、海 藻糖，硝酸钾均为分析纯。 1.4 试验方法 1.4.1 酵母菌的增殖培养
取采摘于果园的成熟冬枣，直接榨汁后自然发酵，当 发酵瓶中有大量气泡产生时，取发酵醪10mL接入90mL酵 母富集培养基中，于28℃培养20h~24h。 1.4.2 酵母菌的分离、纯化、保存
取富集培养液按梯度稀释法，涂布于麦芽汁琼脂培养 基平板，每一梯度做3个平行，于28℃培养48h，挑取具有典 型酵母菌落形态的菌落，分别在麦芽汁琼脂培养基平板上 进行划线分离纯化培养，直至有单菌落出现，镜检观察， 选 出 单 菌 落 ，转 接 至 麦 芽 汁 斜 面 试 管 上 ，28 ℃ 培 养 20h~ 24h，于0℃~4℃冰箱中保藏，备用。按此方法分离得到88株 酵母菌，依次编号为1#~88#。 1.4.3 酵母菌的筛选及性能测试
关 键 词：冬枣；酵母菌；果酒；筛选
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）08-004来自百度文库-04
Isolation and screening of Saccharomyces cerevisae from jujube wine
ZHANG Chenyun, LIU Jinfu, WANG Na, WANG Bujiang
1.4.4 酵母细胞数测定 采用 Neubauer 血球计数板法计数。25×16型血球计数
板的计算公式：
菌细胞数（mL）=
80×小格内菌细胞数 80
×400×10000×稀倍数
1.4.5 冬枣酒发酵试验 （1）工艺流程
冬枣→去杂→清洗→破碎→榨汁→酶解→过滤→调糖，调 pH 值→ 巴氏杀菌→接种酵母→发酵→陈酿→装瓶→杀菌→成品
冬枣营养丰富，含 有 19 种 人 体 氨 基 酸 ，VC 含 量 为 352mg/100g，被称为“活维生素丸”。冬枣采后常温下货架 期极短，大约1周开始失水、腐烂、褐变，丧失食用价值；低 温条件下贮藏冬枣果实，后期则发生腐烂、酒软、褐变，这 些都严重制约着冬枣产业的发展[1-3]。随着冬枣产量的迅速 增加，除了贮藏保鲜供应人们鲜食外，对冬枣进行深加工， 不断提高附加值，是 保 证 我 国 冬 枣 产 业 持 续 健 康 发展的 必然途径。冬枣果酒的酿造是以冬枣果汁为原料，通 过 优 良 酵 母 菌 种 进 行 发 酵 而成的低度饮料酒。在果酒酿造 中，酵母菌是发酵的原动力，优良的生产菌种是决定果酒 品质的关键。目前工业上用于果酒酿造的酵母多为葡萄酒 酵母，其是针对葡萄及葡萄酒生产工艺的特点开发出来的， 而葡萄与冬枣果汁的成分及酿造环境差别很大，用葡萄酒 酵母酿造冬枣果酒会产生所酿果酒口味欠佳的问题。张新 明 等 [4]采 用 鲜 枣 榨 汁 添 加 安 琪 酿 酒 活 性 干 酵 母 发 酵 ； 王颉等[5-6]将红枣、甘肃临泽小枣浸提，使用葡萄酒活性干 酵母发酵；赵静等[7]采用鲜冬枣浸泡在小曲酒制成冬枣果 酒；杨幼慧等[8]是应用葡萄酒酵母发酵发酵荔枝酒。可见， 在我国专用型果酒发酵菌种的研究与应用还很薄弱。
为适应果酒市场生产的需要，积极地从自然界含菌 材料中，筛选优良酵母菌种的研究工作具有重要意义。根 据冬枣果实含糖 量 高 和 含 酸 量 相 对 比 较 低 的 特性，本试 验筛选耐糖性和耐酒精性强的天然酵母菌。
1 材料与方法 1.1 原料及试剂
冬枣：采自于天津市静海冬枣果园。 对照菌株（CK）：法国F-15#葡萄酒活性干酵母。 1.2 仪器设备 HZQ-Q型全温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限 公司；HR1707型飞利浦搅拌机：珠海飞利浦家庭电器有限 公司；HBYQ电热恒温培养箱：天津市华北实验仪器有限 公司；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申 安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型净化工作台：苏州净化设备有 限公；OLYMPUS BX-41生物显微镜；WY型手持糖量仪： 成都万辰光学仪器厂；冰箱；生物实验室常用设备等。 1.3 培养基 1.3.1 酵母菌分离纯化培养基 斜面及平板培养基：麦芽汁琼脂培养基[9]。 种子培养基：麦芽汁液体培养基。 富集培养基：葡萄糖5%，磷酸二氢钾 0.25%，尿素0.1%， 酵母膏0.05%，硫酸镁0.1%，硫酸铁0.01%，孟加拉红（1%的 水溶液）0.023 %，于 121℃高压灭菌15min。 1.3.2 冬枣汁发酵培养基 经成分调整的冬枣原汁，于115℃高压蒸气15min间歇 灭菌2次。 1.3.3 酵母菌鉴定培养基[10]
（2）成品的感官检验 主要包括对酒体的色、香、味的评价，采用嗜好性感官 评定法。用葡萄酒活性干酵母作对照。 1.4.6 酵母菌的鉴定 酵母鉴定方法参考文献[11-13]。 酵母菌形态与培养特征观察：将分离菌种接种到麦 芽汁液体培养基中，28℃恒温培养3d~7d，观察培养液的浑 浊情况，是否形成环或岛，沉淀量多少以及紧密程度，采用 美兰染色水浸法制片，于显微镜下观察细胞形态，出芽方 式，死活细胞鉴定；同时将分离得到的酵母菌划线接种在 麦芽汁琼脂培养基平板上，28℃恒温培养2d~ 3d，观察其 菌落形态特征。 酵母假菌丝的观察：将菌株活化后，接种于玉米淀粉 琼脂培养基平板上，在平板上划线接种（每个板2~3条）， 在菌线上盖上无菌盖玻片，在28℃培养5d~10d观察。 酵母菌子囊抱子的观察：在接种到生抱培养基之前，将 菌株在麦芽汁培养基上，28℃重新培养1d~2d，进行活化， 将已活化好的酵母在产抱子培养基斜面上划线，28℃培养 3d，镜检是否有子囊孢子（子囊孢子绿色，营养细胞红色）。 未见孢子的在17℃左右保持4~6周，每周再检查是否出现 子囊孢子。注意观察子囊形前是否有接合现象，子囊与子 囊孢子的形状，每一子囊内孢子的数目。 发酵糖类试验：鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、麦芽糖、 半乳糖、乳糖和蔗糖。将一定量的糖分别加入到含有杜氏 发酵管的生理生化培养基中。酵母菌经活化后分别接入 到上述培养基中，28℃条件下培养，每隔2d观察发酵情况， 连续观察2周，每次观察时注意杜氏小管中CO2的量，以及 出现的速度，判断发酵情况。以杜试管中有气泡计为阳性， 无气泡为阴性。重复3次。 （5）同化碳源试验：鉴定所需同化物质共16种，为半乳 糖、棉籽糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、D-木糖、D-甘露糖 醇、纤维二糖、L-阿拉伯糖、琥珀酸、海藻糖、D-核糖、柠檬 酸、乳糖、L-鼠李糖和肌醇。将一定量的糖分别加入到含有 杜氏发酵管的氮源基础培养基中，以含YNB而不含碳源的 试管作为不生长的空白对照。酵母菌经活化后分别接入 到上述培养基中，28℃条件下培养分别在第1、2和第3周观 察，以试管中出现混浊计为阳性，否则计为阴性。重复3次，
为获得一株或几株各种性能良好，且适于酿造不同类 型冬枣酒的酵母菌，对分离的酵母菌株进行进一步筛选。
酵母菌的初筛选：采用杜氏管发酵法。在28℃条件下， 测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气泡的多 少（以48h为标准），初步比较各株酵母菌的起酵能力和发 酵能力，试验平行重复3次。
酵母菌的复筛选：将经过初筛选出的菌株进行发酵 速率、耐酒精性、耐糖性试验。
产子囊抱子培养基：酵母膏0.3%，麦芽汁0.3%，蛋白 陈0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%，于121℃灭菌20min。
生理生化基础培养基：（1）氮源基础培养基：酵母膏 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.1%，（NH4）2SO4 0.5%； （2）碳源基础培养基：葡萄糖1%，KH2PO4 0.1%，酵母膏 0.1%，MgSO·4 7H2O 0.05%。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 8 期
总第 221 期 ·43·
冬枣果酒酿造酵母的分离筛选研究
张陈云，刘金福，王 娜，王步江
（天津农学院 食品科学系，天津 300384）
摘 要：对冬枣表皮和自然发酵的冬枣汁中的野生酵母菌进行了筛选。经过菌种富集培养和多次平板稀释分离培养、划线分离纯化 培养得到88株菌，采用杜氏管发酵法，CO2失重比较法等从中筛选出一株能耐受12%vol酒精和25°Bx糖度，发酵性能优良的酵母菌株 命名为TN9#，经初步鉴定TN9#菌株属于酵母属的酿酒酵母，可作为冬枣酒发酵专用菌种或冬枣果酒专用菌种选育的出发菌株。
收稿日期：2010-05-25 基金项目：天津农学院科学发展基金计划（2006002） 作者简介：张陈云（1979-），女，实验师，主要从事食品加工、食品发酵工程技术研究工作。
2010 No．8
·44· Serial No．221
China Brewing
Research Report
玉米粉琼脂培养基：将12.5g黄玉米粉溶于300mL水中， 搅 匀，以60℃热水预保温1h，用滤纸过滤，滤液加水至 300mL，加琼脂3.8g，121℃灭菌15min。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 8 期
总第 221 期 ·45·
以不加糖的培养基为对照。 （6）同化氮源试验：以硝酸钾为唯一氮源。方法参照
同化碳源试验。 2 结果与分析 2.1 酵母菌初筛
采用杜氏管发酵法对分离出的88株出发菌株进行初 筛。杜氏管发酵试验结果见表1。
发酵时间/h 10 16 24 48
(Department of Food Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
Abstract：In order to obtain optimal yeast for jujube wine making, wild yeast was screened from jujube surface and natural fermented jujube juice. Eighty-eight yeast strains were isolated by enrichment culture, dilution-plate and streak-plate purification. One yeast strain named as TN9#, which could grow under 12% alcohol and 25°Bx (sugar content) with superior fermentation capability, was selected by Durham tube test and CO2 weight loss. TN9# was preliminarily identified as Saccharomyces cerevisiae, and could directly serve for jujube wine making or act as the original strain for breeding of new strains. Key words：jujube; yeast; fruit wine; screening
表1 杜氏小管产气结果 Table 1. Results of Durham tube test
产气情况 + ++