免疫组织化学注意事项

细胞免疫组织化学实验流程及注意事项

九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。

贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。

需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。

之后可按组化常规方法进行。

封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。

另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。

使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

免疫组织化学的一般注意事项有

免疫组织化学中的注意事项
免疫组织化学是一项重要的实验技术，在生命科学研究中有着广
泛的应用。

然而，进行免疫组织化学实验需要注意一些细节和技巧，
以确保实验结果的准确性和可重复性。

以下是一些免疫组织化学中的
注意事项。

1. 标本预处理：标本的质量对结果影响很大。

在进行组织染色前，需要对标本进行处理，如切割、固定、脱水等。

标本中的脂类和胆固
醇会干扰标本的染色过程，因此需要彻底去除。

2. 抗体和抗原的配对：在进行免疫组织化学染色时，抗体和抗原
的配对至关重要。

不同的抗体可能对同一抗原具有不同的亲和力和特
异性，因此需要根据实验需要选择适当的抗体。

3. 免疫染色的条件：免疫染色条件也需要严格控制。

温度、时间
和缓冲液的组成都可以影响染色效果。

一些组织样本可能会对染色条
件很敏感，因此需要在实验过程中不断优化条件。

4. 染色结果的评估：染色结果需要准确评估，包括染色强度、特
异性和位置等。

这需要使用显微镜进行观察和分析，并需要有足够的
经验来检验染色结果的可靠性。

综上所述，免疫组织化学实验需要严格控制各项细节，并需要有
充足的实验经验和科学思维能力。

只有这样，才能获得可靠的实验结
果并推动生命科学的发展。

免疫组化的原理及操作规程

免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。

该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。

本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。

一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。

抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。

抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。

在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。

免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。

直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。

间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。

间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。

二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。

固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。

2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。

常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。

具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。

3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。

免疫组化需要注意事项

免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。

为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。

如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。

因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。

三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。

如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。

如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。

如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。

四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。

免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。

新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。

我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。

然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。

五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。

免疫组化原理、步骤及要注意的事项

免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项

免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项免疫组织化学技术是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的方法，通过使用抗体来实现。

在进行免疫组织化学技术时，选择合适的抗体至关重要，因为抗体的质量直接影响到结果的准确性和可靠性。

在选择抗体时，需要考虑许多因素，包括特异性、灵敏度、特异性和重现性等。

需要注意一些实验中的常见问题，比如非特异性结合、交叉反应和背景信号等。

下面就关于免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项做一些介绍。

一、抗体的选择方法1. 确定目标蛋白：在选择抗体之前，首先需要明确目标蛋白的特性和表达模式，比如它的亚细胞定位、分布情况和表达水平等。

2. 搜索合适的抗体：可以通过文献检索、商业抗体数据库、生产商提供的数据和其他实验室的经验等渠道来获得相关信息，然后筛选出合适的抗体。

3. 考虑实验条件：在选择抗体时需要考虑实验所需的条件，比如实验类型（免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹等）、样本类型和处理方法等。

二、抗体的注意事项1. 抗体的特异性：选择具有较高特异性的抗体是十分重要的，避免出现与非目标蛋白的结合。

2. 抗体的灵敏度：选择具有较高灵敏度的抗体有助于检测低表达水平的蛋白。

3. 抗体的特异性验证：在使用抗体之前，最好通过Western blotting、siRNA敲低等方法对抗体进行特异性验证。

4. 购买抗体时需要关注生产商提供的抗体性能数据，如免疫组织化学应用图片、抗体的批次一致性以及使用文献等。

免疫组织化学技术中选择合适的抗体是影响实验成败的关键因素之一。

在选择抗体时需要全面考虑各种因素，严格控制实验条件并加强抗体的验证工作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

也需要不断总结实验中的经验，加强与其他实验室的交流与分享，以提高免疫组织化学技术中抗体的选择水平和实验技术水平。

免疫组化

免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。

科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。

影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。

因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。

一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。

冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。

因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。

二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。

常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。

固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。

冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。

三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。

较常用效果较好的是硅化玻片。

硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。

2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。

3. 无水丙酮液浸1-2min。

3. 蒸馏水浸洗1-2min。

4. 烤干备用。

可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。

＊ APES(3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE) 氨丙基三乙氧基硅烷SIGMA产品。

病理学中的免疫组织化学技术使用教程

病理学中的免疫组织化学技术使用教程免疫组织化学技术是一种常见且广泛应用于病理学研究的分析方法。

它通过将特定的抗体与组织标本中的抗原相互作用，从而提供关于细胞或组织中蛋白质表达和定位的信息。

本文将为您介绍免疫组织化学技术的使用方法和注意事项。

一、实验所需材料和试剂在进行免疫组织化学实验之前，准备好以下材料和试剂是必要的：1. 抗体：选择特异性强、经过验证的一抗，可以有多种来源如商业供应商或自制。

2. 血液清晰剂：例如牛血清白蛋白（BSA）或牛血浆等。

3. 缓冲液：常用的有生理盐水、Tris缓冲液等。

4. 清洗液：例如磷酸盐缓冲液、Tween-20等。

5. 可可粉末或3,3'-二氨基联萘（DAB）显色底物。

6. 高质量的显微镜玻璃片、载玻片和封片剂。

二、步骤以下是进行免疫组织化学实验的通用步骤：1. 组织样本准备：采集病理标本并固定在适当的组织固定剂中，如4%的中性缓冲甲醛。

确保标本大小适宜，以便于透明度好和抗体能够充分作用。

2. 标本处理：将固定的组织样本进行去水和石蜡包埋等处理。

3. 反应抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂（例如胰蛋白酶）进行抗原修复以恢复抗原的活性。

根据不同抗原的性质选择适当的修复方法。

4. 抗体染色：将组织样本与目标抗体进行孵育。

将抗体稀释到推荐浓度中，根据实验要求选择合适的时间和温度进行孵育。

5. 清洗：用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的抗体。

6. 二抗处理：加入适用于一抗的二抗，例如抗IgG。

二抗通常与标记物（如酶或荧光染料）结合，以便于检测。

7. 清洗：再次用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的二抗。

8. 显色：接下来加入可可粉末或DAB等显色底物，观察标本是否出现所需的显色反应。

9. 染色修复：在显色后，如果需要的话，可以执行染色修复以增强显色效果。

10. 去水和挂片：用梯度酒精进行去水，然后将样本挂片，以便于后续显微镜观察。

三、注意事项在进行免疫组织化学实验时，需要注意以下几点：1. 实验室安全：实验时应遵守实验室安全操作规范，戴上手套和口罩，避免接触到可能有害的试剂和组织样本。

免疫组织化学技术操作规范及制度

免疫组织化学技术操作规范及制度
1．免疫组化技术员必须经过专门培训与考核授权后，才能进行免疫组化技术操作。

2、每一批次的免疫组化染色必须设阳性对照，可利用组织中的内对照。

3、必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并及时更新。

4、更换抗体后，需要有用阳性和阴性组织进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2 年。

5、免疫组化染色过程中产生的有毒液体（如DAB）应专门回收，严禁随处倾倒。

6、病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。

7、单纯的免疫组化染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断。

8、免疫组化染色的质量要达到室间质评的合格标准。

9、通过实验室室内质控与室间质控，提高免疫组化染色的质量。

10、根据医学新进展，及时改进染色技术，提高免疫组化染色质量。

免疫组化原理、步骤及要注意的事项.

免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组化操作规程

免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。

下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。

注意保护好标本的完整性和质量。

2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。

3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。

4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。

5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。

6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。

7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。

8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。

以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。

希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。

做好免疫组织化学染色的几个注意点

做好免疫组织化学染色的几个注意点免疫组织化学染色是一种常用的方法，用于检测组织和细胞中的蛋白质表达。

在进行免疫组织化学染色之前，需要注意以下几个方面，以确保染色的质量和准确性。

一、样本处理样本处理是免疫组织化学染色的关键步骤之一。

前期的样本处理将直接影响后期染色的效果。

一般来说，样本处理包括取材、固定、脱水、透明化、包埋、切片等步骤。

样本应该在取材后立即进行固定以防止蛋白质的损失和蛋白质异构体的变化。

同时，固定液中的药剂成分要根据不同蛋白质的特性进行选择，不同的药剂成分固定时间也应根据蛋白质的大小和分子量来进行优化调整。

二、抗体选择抗体是免疫组织化学染色的核心。

正确选择适宜的抗体对于染色结果至关重要。

在选择抗体时，应该注意以下几点：1、抗体应具有较高的亲和力和特异性，以确保染色的敏感性和选择性。

2、抗体的来源、克隆和浓度也很重要。

来源纯度应高于90%；与生物标本的物种有较高相似度的源（例如，兔、小鼠）的单克隆抗体效果更好。

浓度不能太高，否则会导致非特异性结合。

3、对于多蛋白共存的样本，应选择不同引物或标记抗体，以避免交叉反应。

三、标记物选择标记物的选择也影响到染色的结果。

多种标记物可应用于免疫组织化学染色，如酵素标记、荧光标记和金标记等，根据实验需要选择适当的标记物进行染色。

四、染色方法的优化免疫组织化学染色的过程需要进行优化，包括抗体浓度、背景消除步骤、染色时间和条件、固定剂和诱导剂浓度选取等等。

这些步骤都需要在实验室中进行研究和优化。

其中比较关键的是控制抗体浓度，以及对于背景的消除，可进行多次亲和吸附过程，获得更好的染色结果。

总之，免疫组织化学染色是一种重要的实验技术，它能够让我们观察到细胞和组织中蛋白质的分布和存在情况。

在实际应用中，我们需要注意样本的处理、抗体和标记物的选择以及染色方法的优化等关键步骤，以获得高质量的染色结果。

细胞爬片免疫组织化学染色注意事项

1．将特殊处理过的（转染某个基因或用药物处理后）永生化的活细胞种在某种载体上培养一段时间后形成细胞单层时（注意：细胞不能太密）停止培养，用PBS洗去血清，快速在去离子水中脱盐后用 4度冷丙酮固定30分钟。
2．PBS洗 3．0.3%双氧水封闭10分钟。 4．PBS洗 5．滴加一抗37℃孵育2小时。 6．PBS洗 7．滴加通用二抗。 8．PBS洗 9．DAB显色
二、实验过程中应注意的一些问题
细胞载体的处理：盖片和载片在接种细胞前一定要处理好，不要怕麻烦。盖片和载片入酸前要将所附着的脏东西洗干净。过蒸馏水和酒精时要用镊子一片一片的过，平放在干净滤纸上自然干燥。包装好后经烤箱干烤消毒保存。
2．细胞种植时应注意的一些问题：
选用何种载体：细胞在盖片和载片上一般4小时就可以贴壁并开始生长，如果细胞贴壁后不需再进一步处理，则可以将细胞爬在载片上，载片不用消毒，也可以用DAKO笔在载片上画圈。用 DAKO笔划过圈的载片最好不要干烤消毒。细胞帖壁后还要加药继续培养若干时间的则应选用盖片爬片，这时盖片最好选用160度干烤消毒。
不要放在木制的片盒里，尤其是新的木制片盒，木制品里的甲醛会影响抗原的表达。如果放在新的木制片盒,要做恢复抗原. 细胞爬片制好后最好马上染片.
细胞的亚建康对实验结果的影响
当我们培养细胞时,细胞长得很差时我们会把它们扔掉,不会用它们做进一步的实验.但长得不太好,我们观察细胞时有时分辨不出来,就可能使我们白做工, 既浪费了时间又浪费了经费.这是一个值得我们注意的问题.
此爬片由于该盖片处理得不好,虽爬上细胞但细胞的形态很差,表现在细胞膜和细胞器边界不清晰
U251MG培养细胞 (10hr)扫描电镜图
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免疫组织化学常见问题

免疫组化常见问题及对策尊敬的各位代理，大家好！现在我就免疫组化常见问题及对策向大家做一简要介绍。

我公司所生产的抗体主要有两大用途，一个是免疫组化，另一个就是western blotting. 免疫组织化学是应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽、蛋白质等大分子物质的分布。

这种方法的特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。

作为初次使用本公司的抗体从事免疫组化的客户可能遇到许多问题，大体归纳起来，主要有非特异性着色﹑着色部位不对﹑假阳性﹑无阳性﹑阳性弱五大类以及其他一些小问题。

现在就以上几点分别说明。

一、非特异性着色非特异性着色就是在理论着色区域外的着色，这种着色与背景是有区别性的。

造成非特异性着色的原因主要有：1)标本原因，肝肾内源性生物素含量高，与SABC结合导致非特异性着色，皮肤肺组织胶原含量高，由于胶原带负电荷，易吸附试剂导致非特异性着色。

2)切片干涸导致的边缘效应。

3)抗体浓度过高。

4)组织在处理中存在出血区域坏死区。

5)洗涤不充分。

6)显色剂氧化，显色时间长。

解决方法：1)一抗应做浓度梯度，选择阳性强背景好，信躁比高的浓度，做为抗体实验浓度，二抗浓度和时间一般不变。

2)稳定实验条件，严格按操作说明进行。

3)在实验中应保持切片始终处于水平状态避免抗体流失，从而使切片使切片干涸。

4)在实验中应将试剂覆盖面积大于切片面积5)洗涤要充分，在背景十分深时，可用37℃预温的PBS浸泡6)显色剂的配制要防止氧化，尤其是显色剂的配制是使用的容器，最好是灭菌过的。

显色时间应在显微镜下严格控制。

二、着色部位不对着色部位不对有三种情况。

情况一、本是胞浆抗原，但实验显示结果却在胞核有着色。

原因及解决办法：1)修复时间过长，修复条件十分严苛，这时应降低反应强度，减少修复时间。

2)组织在二甲苯中静置时间过长，这时应更换标本。

3)抗体中含有抗核蛋白抗体，这种情况已不多见。

4)标本原因，标本处理不慎会导致总在同一个地方出现着色。

免疫组化sp法

免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。

相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。

本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。

原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。

HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。

而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。

SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。

实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。

可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。

2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。

使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。

3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。

4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。

5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。

根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。

6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。

在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。

7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。

AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。

8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。

9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。

实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。

2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。

免疫组化技术及注意事项

4、免疫组化阳性结果的统计
Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象
照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄" 度来反映相应蛋白表达的的"量"
4.1 校正光密度
图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致
计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度 gray=255
单克隆抗体技术
1.3 抗体的保存
抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。
酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。
抗体浓缩液-20℃保存两年，融解后抗体于2-8℃ 可以保存一个月，稀释抗体在4℃下可存放1-3天，超过7天效价显著降低。
替代对照
PVN中Fos表达
3、免疫组化正式实验
3.1 步骤
组织固定
脱水透明封片
冰冻切片
阻断内源性酶
显色复染
二抗处理
封闭处理
一抗处理
3.2 注意事项
组织固定保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性
固定液的选择：免疫组化技术成功与否的基础。不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s 液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液
AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片以水性封片剂为主，染色切片不能久存。

人工免疫组化的注意事项及影响因素

人工免疫组化的注意事项及影响因素【关键词】免疫组化；质量控制；抗原修复；原因分析1 免疫组化实验原理与过程免疫组化继承了组织化学用颜色代表化学成分的传统，全过程包括：首先从已知组织细胞中提取出抗原，然后通过免疫动物获得特异性抗体，继而把纯化的抗体标记上示踪剂(可用荧光剂或过氧化物酶)，最后一步则是把标记的抗体与欲检测的组织反应(染色)。

免疫组化反应的位置抗原在细胞膜、细胞浆、细胞核甚至是在某一个细胞器上，有明确的定位，因而假如组织细胞某个部位出现抗体所带的染色，那就表明该处是抗体所在部位，也就是抗原所在的位置，从而证明所检测的组织细胞中有相关的化学成分，因而可以定性检测细胞内各种微生物、蛋白、多糖、核酸甚至DNA、RNA基因表达产物，在一定程度上可以说明组织细胞的代谢途径和功能作用。

因而免疫组化是以形态学为主，形态、代谢、功能相结合的三位一体的科学［1］。

1.1 组织的处理免疫组化反应抗原的准确显示与定位制备的组织细胞标本质量的好坏密切相关。

组织固定应及时充分，及时的固定不仅可使细胞内蛋白凝固，终止外/内源性酶活性，并可最大限度地保存组织细胞的形态结构和抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。

大块组织应及时平行多刀剖开固定，时间以12~24 h为宜，固定剂首选10%中性福尔马林，组织块应选取新鲜无出血坏死并有代表性者，不宜过大过厚，必须小于2 cm×1.5 cm×0.3 cm，厚度≤0.3 cm，微小组织和液体沉淀物先用滤纸妥为包裹后固定。

固定液体积一般大于组织20倍以上。

1.2 防脱玻片的处理以前应用普通载玻片清洗后涂以多聚L赖氨酸防脱剂自己制作防脱片，现在国内病理科内已普遍应用免疫组化专用的商业防脱黏胶载玻片，质量稳定，开盒即用，已无需再处理。

1.3 包埋与切片过热的石蜡液包埋容易破坏溃疡，宜选用低熔点的石蜡(熔点＜60℃)。

切片厚度需在3~5 μm，宜薄不宜厚，过厚的切片不仅影响免疫反应，而且影响镜下观察。

免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项

免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项免疫组织化学技术是一种广泛应用于免疫学和细胞生物学领域的实验技术，它主要依赖于对特定蛋白或抗原进行抗体的选择和使用。

选择合适的抗体对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。

本文将就免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项进行详细介绍。

一、抗体的选择方法1. 确定研究目标：在选择抗体之前，首先需要明确研究的目标是什么，需要检测的蛋白或抗原是什么。

根据研究的目标确定所需的抗体种类和特异性。

2. 确认抗原的性质：对于欲检测的抗原，需要确认其组织定位和表达水平，以便选择合适的抗体。

如果已知抗原的性质，比如分子量、糖基修饰等，可以直接搜索或定制相应的抗体。

3. 参考文献和数据库：在选择抗体时，可以通过文献和数据库检索已有的相关研究成果，了解不同抗体的性能和应用情况，以便做出更加合理的选择。

4. 质控信息：选择抗体时需要考虑其质量控制信息，包括生产厂家、批号、适用应用、稀释比例、保存条件等，确保选用的抗体质量可靠。

5. 进行验证实验：在选择抗体之后，需要进行验证实验，比如免疫印迹、免疫组化等，以确定抗体的特异性和敏感性。

二、注意事项1. 特异性：选择抗体时需要确保其对目标抗原具有特异性。

常规的方法包括免疫印迹、免疫组化、免疫沉淀等实验来验证抗体的特异性。

2. 敏感性：抗体的敏感性对于检测低表达水平的抗原至关重要。

需要选择具有较高灵敏度的抗体，确保能够检测到目标抗原的微量表达。

3. 交叉反应：避免选择具有较高的非特异性或交叉反应的抗体，以免对实验结果造成干扰。

4. 应用范围：在选择抗体时需要考虑其适用的应用范围，比如免疫印迹、免疫组化、流式细胞术等，确保选用的抗体符合实验需求。

5. 存储条件：选用抗体后需要严格按照生产厂家提供的存储条件进行保存，以确保抗体的稳定性和活性。

在免疫组织化学技术中，抗体的选择对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。

通过上述所述的选择方法和注意事项，科研工作者可以更加科学合理地选择适合的抗体，并在实验中取得更加可靠和准确的结果。