实验八、转基因生物的GUS检测
实验八GUS组织化学定位
报告基因GUS的表达的检测
材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心 管中； 3. 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色； 肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现 蓝色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter GUS NOS-ter LB
p动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
考核
成绩计算方法（百分制）：
期末考试: 50分（考试内容包括平时操作和涉及实
验的理论基础）
平时成绩: 50分 (共5份实验报告,每份10分)
基 因 工 程 的 基 本 路 线
质粒DNA提 取和酶切
PCR
连接
转化
• 基因的组织特异性表达
原 理
GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
GUS报告基因范文
GUS报告基因范文GUS报告基因是一种用于筛选转基因植物的报告基因。
它在植物细胞内表达的酵素β-葡萄糖苷酶（β-Glucuronidase，GUS），能够将葡萄糖醛酸（X-Gluc）转化为蓝色产物。
通过观察和分析植物组织的GUS活性，可以判断是否发生了基因转化。
下面将详细介绍GUS报告基因的特点、应用以及实验方法。
1.GUS报告基因的特点（1）GUS基因来自于大肠杆菌，它很少在真核生物中表达，因此不会对植物正常生长发育产生影响。
（2）GUS基因编码的酵素活性能够方便、快速地用染色剂标记出来，实验结果直观可见。
（3）转GUS基因的步骤相对简单，转化率较高，且不需要使用昂贵的设备。
2.GUS报告基因的应用（1）植物转基因筛选：通过观察和分析转基因植物的GUS活性，可以确定哪些植株成功地转化了外源基因。
（2）基因调控研究：GUS报告基因可以用来研究目的基因的表达调控机制，例如在转基因植物中瞬时表达GUS基因，观察其在各种组织和发育阶段的表达情况，可以推测目的基因的启动子活性。
（3）信号传导途径研究：通过构建GUS基因的操纵，可以研究植物信号传导途径中特定基因的表达情况，进而了解信号传导途径的效率和调节机制。
3.实验方法以下是GUS报告基因实验的一般步骤：（1）构建GUS载体：将GUS基因与适合的植物表达载体进行连接，形成GUS转化载体。
（2）遗传转化：将GUS转化载体导入要进行转基因植物研究的植物细胞中，使用适当的生物技术方法（如冲击法、农杆菌介导法）实现遗传转化。
（3）植物筛选：选择经过转化的植株进行分析，通常可以通过PCR、Southern blot、Western blot等技术检测GUS基因的存在。
（4）组织切片染色：收集不同部位的植物组织，例如叶片、根、花等，制作切片。
使用X-Gluc作为底物加入切片中，观察蓝色染色产物的形成。
（5）定量分析：通过测定GUS活性，使用亲合素、含有底物的液体培养基等方法，可以 quantitatively 地测定GUS酶活性。
gus基因检测
gus 基因PCR 反应程序： 94℃预变性5 min 94℃变性1 min58℃退火1 min 30个循环 72℃延伸2min 72℃延伸7 mingus 基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC 3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA 3’GUS 染色母液:X-Gluc 由DMSO 溶解，贮存浓度为l0mg/mL,于-20°C 保存。
GUS 染液:500mg/L X-Gluc, 0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.lmol/L K4Fe(CN)6，0.0lmol/L ，的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml●这是1ml的配方体系：终浓度药品分子量体积0.5M Na2EDTA 20ulTritonX-100 1ul1M 磷酸钠缓冲液（PH7.0） 100ul0.1M K3Fe(CN)6 5ul0.1M K4Fe(CN)6 5ul10mg/ml X-Gulc 200ul去离子水或无菌水669ul染液配方0.05M磷酸缓冲液 4.48ml 5mM铁氰化钾0.05ml, 5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-100 0.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05ml DMF中，终浓度为0.5mg/ml37度染色过夜1.2染色步骤1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。
2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
4)记录：在体视显微镜下拍照记录。
2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。
转基因植株的GUS染色
转基因植株的GUS染色1、X-Gluc 母液：100 mg X-Gluc溶于5 ml DMF中；2、基液：50 mM PBS pH7.0(NaH2PO450 mM 0.78 g/100 ml, Na2HPO450 mM 1.791 g/100 ml)溶解EDTA·2Na(10 mM, 372 mg), Triton-100(0.1％,100 μl), 铁氢化钾(0.5 mM, 16.5 mg)，亚铁氢化钾(0.5 mM, 21.1 mg)定容至100 ml；3、X-Gluc使用液：50 μl母液＋950 μl基液，混匀备用，可存放于－20℃。
取合适大小的转基因苗浸入GUS染液中，37℃染色1-24小时直到染出理想效果；吸去反应液，乙醇梯度脱色。
体视镜观察并拍照。
这是转基因植株的染色，我想也可以用来做愈伤的染色。
GUS染色protocols2007-06-11 05:25Tissue for GUS staining was gently fixed by incubation in 90% acetone, on ice, for 15 to 20 min and then rinsed in 50 mM NaPO4, pH7.2, 0.5 mM K3Fe(CN)6, and 0.5 mM K4Fe(CN)6. The tissue was then placed in staining solution (50 mM NaPO4, pH 7.2, 2 mM X-gluc[Gold Biotechnology, St. Louis, MO], 0.5 mM K3Fe[CN]6, and 0.5 mMK4Fe[CN]6), vacuum infiltrated, and incubated at 37°C overnight. After staining, the tissue was processed through an ethanol series (30, 50, 70, 85, 95, 100, and 100%), with the 50% step of the series replaced by a 1 -hr formaldehyde-acetic acid fixation (50% ethanol, 5% acetic acid, and 3.7% formaldehyde). To prepare tissue for histological analysis, we passed tissue through a xylene series and embedded it in Paraplast (Sigma). Sections (10 μm) were cut from the embedded tissue, wax was removed by a brief incubation in xylene, and sections were mounted in Paraplast. Sections were visualized using dark-field illumination. (Leslie E. Sieburth et al Plant Cell, 1997, 9, 355-365)1. 染色材料在90％的丙酮中固定15－20min2. 漂洗后，加入GUS染液，抽气，37度过夜3. 乙醇脱色（30，50，70, 95, 100％的依次梯度）后，加入FAA固定液4. 包埋，按石蜡切片步骤进行二、GUS histochemical stainingStock50mM K3Fe(CN)6 0.82315 g/50 ml50mM K4Fe(CN)6 1.056 g/50 ml1M Na2HPO4 7.1 g/50 ml1M KH2PO4 6.8 g/50 ml0.5M Na2EDTA 18.612 g/ 100ml(直接加入 NaOH crystal，調pH = 8.0 )10﹪Triton X-100 1ml/10mlStaining solution（有毒，請戴手套操作）Stock final conc. 1M Na2HPO4 100mM phosphate buffer 0.64ml1M KH2PO4 0.36ml0.5M Na2EDTA 10mM 0.2ml50mM K3Fe(CN)6 0.5mM 0.1ml50mM K4Fe(CN)6 0.5mM 0.1ml10﹪Triton X-100 0.1﹪ 0.1mlMeOH（有毒） 10﹪ 1mlx-gluc 0.3﹪ 30mg以250μl DMSO（有機溶劑）溶解，加水至1mlTotal volume 10ml1. 剪取sample，將 staining solution 加入至可淹沒sample 為止2. 抽氣5min，37℃ incubate O/N3. 以70﹪ EtOH 洗掉葉綠素。
【实验】β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS) 组织化学染色检测转基因植物
材料呈白色。 4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为
GUS表达位点。 5．组织可在70%乙醇中保存数日。
整理课件
整理课件
整理课件
用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活 性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累； 3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然， 也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但 这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定， 因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3） 在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象， 但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾 或者二者都加来使这种渗减至最少；4）同所有的组织化学方法
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μl的N，N-二甲基甲酰胺 （DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
4．X-gluc反应液：取6.5μl X-gluc母液于500μl buffer中 5．70% 乙醇
整理课件
实验步骤
1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基 因的烟草叶片切成小块，浸入盛有100μl染色液的 0.5ml的离心管中。
1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液 A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、 0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
GUS组织化学染色
GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。
2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM ED TA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-1004．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRIT ION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%2 0for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf /stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalS taining.pdf/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.p dfGus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassium phosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g --->200mlKH2PO4: 27.2g---->200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4----> 300ml 1M potassium phosphate b uffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use. Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2mol/L Na3PO4缓冲液(62mL0.2mol/L Na2HPO4;38mL0.2 mol/L NaH2PO4)，pH7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4·H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5mlK4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1mlNaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9mlX-Gluc 0.1% 10ul。
实验八、转基因生物的GUS检测
精选ppt课件
2
原理
•
适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶
（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因
此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或
蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
精选ppt课件
3
相关知识链接——标记基因
•
标记基因是帮助对转基因生物体进行
筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标
记基因和报告基因。
Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解； Na2EDTA （10mM， 372mg），Triton-100（0.1％，100μl）, K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg） • 染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液
敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。 • (4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的
检测。
精选ppt课件
6
常见的报告基因：
• 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有 以下几种：
常用的报告基因包括β—葡萄糖苷酸酶报告基因
(gus), 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基 因(ocs)、新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素乙酰 转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，βgalactosidase)、萤光素酶(luc，luciferase)、和 绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence
精选ppt课件
8
gus基因简介
• gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－ 葡 萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶
(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以 将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） 分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简 单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
实验八GUS组织化学定位
实验七、转基因植物中报告基因 GUS组织化学定位检测
如何检测基因的组织特异性表达？
• 基因的组织特异性表达主要是由该基因特异 性启动子决定的。即，某些启动子有组织特 异性，它会启动该基因的特异性表达。
• 启动子没有基因特异性，它会启动任何下 游基因的表达。
• 只要知道启动子在什么部位表达，就可以推 测出该启动子所启动的基因的表达部位。 • 启动子的表达如何才能肉眼可见呢？——连 接报告基因（GUS,分解底物呈蓝色）。
报告基因GUS的表达的检测
材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心 管中； 3. 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色； 肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现 蓝色。
实验报告
ห้องสมุดไป่ตู้ 转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter GUS NOS-ter LB
pBI101
花椰菜花叶病毒( CaM V)启动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
实验七GUS报告基因的检测
实验七 GUS报告基因的检测
一、实验目的
学习转基因植物中报告基因的定性检测方法和技术。
二、实验原理
GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式，而且GUS染色的稳定性好，组织定位精确，在植物转基因过程中可作为报告基因来反映质粒侵染的情况。
三、实验仪器、药品、材料与试剂
1．仪器：37℃保温箱、电子天平、移液器、体式显微镜
2．药品与材料：Na2HPO4、Triton X-100、铁氰化钾、亚铁氰化钾、EDTA、X-Gluc、O
ddH
2
3、试剂：磷酸缓冲液
四、实验内容与步骤
1．按表1配制GUS染色的底物。
2．染色步骤
1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS
染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。
2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
4)记录：在体式显微镜下拍照记录。
五、观察记载内容与实验报告
1、观察并记录转基因甜瓜/烟草愈伤组织染色情况。
2、记录转化率。
转化率=蓝色愈伤组织数/总接种愈伤组织数 *100%
表1. GUS染色底物的配制
* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。
0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性一、试剂准备：1.GUS提取缓冲液：●50mmol 磷酸钠(PH7.0)●10mmol EDTA●0.1% Triton X-100●0.1% Sarcosyl●10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/L 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。
4℃暗处可以贮存一个月。
贮存中有可能发生结晶。
3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。
4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。
二、操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：A.取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。
B.2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
C.3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。
GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。
按上表制作BSA梯度液。
从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。
吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。
测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。
GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。
2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。
gus染色技术在遗传学实验教学中的应用
gus染色技术在遗传学实验教学中的应用Gus染色技术是一种常用的植物细胞组织活性染色技术，它可以用来
观察植物细胞中酵素表达的变化情况。
在遗传学实验教学中，Gus染色技
术被广泛应用，它可以帮助学生更好地了解植物基因表达的过程，同时也
可以培养他们的实验操作能力和科学思维能力。
以下是Gus染色技术在遗传学实验教学中的几个应用场景：
1.观察基因表达的时空特点。
Gus染色是一种靶向不同时间和组织区域检测基因表达的方法，可以
在植物发育早期就对各种组织部位的基因表达进行检测。
学生可以通过观
察Gus染色结果来探索基因表达的时空特点，并分析影响基因表达的因素。
2.研究转基因植物的表达情况。
Gus染色技术是一种便捷而又经济的评价转基因植物表达情况的方法。
学生可以借助Gus染色法观察转基因植物中Gus基因的表达情况，从而研
究转基因植物在不同条件下的表达情况和转基因效率。
3.分析基因调控。
Gus染色技术还可以用于研究基因调控，尤其是在探讨转录因子对基
因表达的影响时。
学生可以将GUS基因与某些特定基因的启动子结合，以
便对基因表达的调节进行详细的观察和研究。
4.探究物种间的基因表达差异。
Gus染色技术可以用于探究不同物种之间基因表达的差异。
学生可以
通过比较不同物种的Gus染色结果，了解它们的遗传差异和进化关系，并
深入探究这些差异引起的生物学功能变化。
总之，Gus染色技术在遗传学实验教学中具有重要的应用和意义，它可以帮助学生深入了解植物基因表达的机制，掌握实验操作技能，并启发他们的科学思维和能力。
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸的底物。
在实验中，通过对含有β-葡萄糖苷酶的细胞或组织进行Gus染色，可以直观地观察到β-葡萄糖苷酶的活性分布情况，从而对生物学研究提供重要的信息。
Gus染色的原理主要包括底物、酶作用和染色三个步骤。
首先是选择合适的底物，通常使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷（X-Gluc）作为底物，它在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生可染色的产物。
其次是酶作用，β-葡萄糖苷酶在底物的作用下水解产生的产物，这些产物会与染色剂发生化学反应，形成蓝色的沉淀物。
最后是染色，将样品浸泡在染色液中，待染色完成后观察样品的染色情况。
Gus染色的实验步骤相对简单，但在实验过程中仍需注意一些关键的技术细节。
首先是对样品的处理，样品的预处理对实验结果有着重要的影响。
其次是对底物和染色剂的选择，合适的底物和染色剂可以提高实验的准确性和可靠性。
最后是对实验条件的控制，包括温度、时间、pH值等因素的控制都会对实验结果产生影响。
Gus染色技术在生物学研究中有着广泛的应用，特别是在植物和微生物领域。
通过对植物组织进行Gus染色，可以观察到β-葡萄糖苷酶在不同组织和不同发育阶段的表达情况，从而研究植物的生长发育过程。
在微生物研究中，Gus染色也常用于检测转基因微生物中外源基因的表达情况，为基因功能研究提供重要的数据支持。
总的来说，Gus染色是一种简单而有效的生物学实验技术，通过对β-葡萄糖苷酶活性的检测，为生物学研究提供了重要的手段。
在实际应用中，我们需要充分理解其原理和操作技巧，才能更好地利用这一技术进行科学研究。
希望本文对Gus染色的原理有所帮助，谢谢阅读！。
抗冻蛋白-GUS基因诱导融合表达载体转化草植株中GUS活测定
抗冻蛋白-GUS基因诱导*融合表达载体转化*草植株中GUS活
*测定
把修饰合成的带有甘薯信号肽序列的抗冻蛋白成串基因与β-葡萄糖醛*苷酶(GUS)报道基因融合克隆在大豆热休克启动区下游构建了温度诱导型双元载体pBF04,三亲株配对法转化根癌农杆菌,叶盘法导入*草,获得了转基因*草植株.将10株转基因*草放置在40℃诱导不同时间,利用荧光光度分析法测定水解液中GUS活*,结果诱导18、24、48小时的4株中GUS活*明显高于对照组和诱导6、12小时组,说明我们修饰合成的抗冻蛋白与GUS基因融合构建的载体在热休克启动区控制下可以诱导表达.经组织化学法测定这些阳*植株的叶片和茎段切片细胞间隙显示GUS活*,提示甘薯信号肽可能起作用.。
实验七转基因水稻报告基因的检测
四、作业 1.目前在转基因植物研究中常用的报告基因有哪些？ 2.可采用哪些方法对GUS报告基因进行检测？
gus被称为转基因植物的报告基因。
未转基因植物中，β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶及其所催化的反 应几乎完全不存在。
Xh LB 35S-ter Xh E Sa P E P S X B Sa
B
H
RB
hpt
35S-pro
232Wx-pro
232Int1 Wx frag
gus
Nos-ter
三、实验步骤
1.取转基因稻米24粒，剥去颖壳。 2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液 10ul。 3.37º C保温2小时。 4.GUS+、GUS- 计数，并计算比值。
实验七 转基因水稻GUS报告基因的检测
一、实验目的 通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告 基因（gus）表达活性的操作方法，并掌握通过 GUS阳性和阴性分离比推测外源基中，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的
作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。当把表达β葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，该 酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5溴-4氯靛蓝。该反应很容易用普通的生化反应检测出来，由此
GUS 活性检测(总)
GUS 活性检测目的：通过Gus活性测定了解或研究Gus基因是否转化进入植物细胞；Gus基因在植物组织、细胞内的表达部位；Gus基因在植物细胞内瞬时表达量及稳定表达量；外源基因在植物细胞内的表达调控。
材料：转化的植物组织、器官、原生质体、种子的胚及萌发的幼苗等。
一、组织化学染色法试剂：(1)200mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。
取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O 调至7.0。
(2)＊说明：GUS活性的精确定位需要有亚铁离。
GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2－，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。
(3)FAA固定脱色液：5％甲醛，5％乙酸，5％乙醇。
材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后1-5天的材料，稳定表达取转化后处理6周后的材料。
(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。
(3) 悬浮细胞、原生质体低速离收集，无菌等渗液洗涤。
(4) 清洁的愈伤组织可以直接使用直接染色法(1)将准备好的材料浸泡在染液中，于25-37℃保温1小时至过夜。
(2)叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。
(3)肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
固定染色法(1)将材料浸入固定液中，必要时可抽真空1分钟，室温下轻摇30-60分钟。
(2)取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3-4次。
GUS基因检测实验报告
一、实验原理：1、适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
二、实验步骤：1、将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；2、37℃培养箱中温育1小时至过夜；3、将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
4、观察结果。
三、实验结果：转基因拟南芥野生型拟南芥（上）转基因拟南芥；（下）野生型拟南芥转基因拟南芥（作图上行从左数第一个的放大）四、分析讨论：1、预期结果：转基因植株被染成蓝色，野生型植株不被染色。
实际结果：与预期结果一致，但野生型脱色不完全，有几片叶子的叶绿素未被脱掉。
分析：实验较为成功。
由上图可知，转入的基因在整棵植株都有表达，其中蓝色在叶脉中最深，推测转入的基因在叶脉中表达最多。
在野生型植株中，大部分叶子被乙醇脱去叶绿素而呈现浅黄色。
2、gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
3、gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
4、gus基因是一种报告基因，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研究实验中。
GUS基因的定性和定量检测
1．GUS报告基因的定性检测GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。
GUS染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。
1.1 GUS染色底物的配制按下表1配制GUS染色的底物。
表1. GUS染色底物的配制GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。
MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。
因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。
2.1 试剂配制1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。
2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。
3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。
4) 10％ SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。
5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。
6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。
7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
GUS基因检测
GUS基因检测一、仪器设备：恒温箱、超净工作台二、器具：1.5ml的塑料管、镊子、解剖刀等三、材料：转化的愈伤组织四、试剂及其配制：50mmol/l的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）：A液：取NaH2PO4.2H2O 3.12g溶于蒸馏水，定溶至100ml。
B液：取Na2HPO4.12H2O 7.17g溶于蒸馏水，定溶100ml。
取A 液39ml与B 液61ml混合，定容至400ml，调PH至7.0。
50mmol/L铁氰化钾母液：称3.295g，用蒸馏水定容至200ml50mmol/l亚铁氰化钾母液：称4.224g ，用蒸馏水定容至200ml。
0.5mol/l EDTA母液（pH8.0）：药品分子量100ml 500mlEDTA Na2 2H2O 372.24 18.6g 93.06g双蒸H2O 80ml 400ml用NaOH调PH至8.0 6g 10gDdH2O定容至100ml 500mlGUS检测液的配制：甲醇、Gluc、DMF100mgGluc，先溶于1ml的DMF。
取80ml 50mmol/l的磷酸钠缓冲液（pH 7.0），加入1ml 50mmol/L铁氰化钾、1ml 50mmol/L亚铁氰化钾和2ml 0.5mol/l EDTA （PH 8.0），再加入已溶解的Gluc，再加20ml的甲醇，混匀。
（配制方法参考《现代植物生理学实验指南》p348）将配好的GUS检测液分装于1.5ml的塑料管中（1ml/管，1组1管），－20°C 保存备用。
gus基因就是转β-葡糖醛酸酶基因该基因产物为GUS 蛋白质，相当稳定而不易降解，并为一水解酵素，有简易的测定方法；且可使用市售的基质(substrate) 在原位(in situ) 显现出酵素的活性，以肉眼即可检测其产物，非常方便。
GUS活性的定量检测
GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。
试剂：①磷酸缓冲液母液：0.2M Na2HPO4：71.64g/L Na2HPO4·12H2O0.2M NaH2PO4：31.21g/L NaH2PO4·2H2O②GUS抽提液（1L）：PH=7.00.2M Na2HPO4152.5mL0.2M NaH2PO497.5mL14.3M β-ME 700uLNa2-EDTA·2H2O 3.72gTriton-X 100 1mL③10mM 4-MUG（10×）：105.6mg 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中，4℃避光保存。
（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。
④0.2M Na2CO3反应终止液（1L）：21.2g Na2CO3溶于1000mL ddH2O。
⑤BSA母液（4ug/ul）：40mgBSA溶于10mL ddH2O⑥4-MU母液（10mM）：17.6mg 4-MU溶于10mL 0.2M Na2CO3中，4℃避光保存。
⑦Protein Assay Buffer（5×，Bio-Rad cat.no.500-0006）：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液仪器及用品：酶标仪TECAN Infinite M200酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent和Greiner 96 Flat Black）操作步骤与注意事项：1.材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。
（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近，方便后续操作。
）2.10000g 4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4度短期保存或于-70℃长期保存；但不要存于-20℃，该温度下GUS不稳定）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
染色方法
– 将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃ 保温1小时至过夜。
– 叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3 次，至阴性对照材料呈白色。 – 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色 小点即为Gus表达位点。
实验步骤 • 将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加 入染色液浸没试材，封好盖子； • 37℃培养箱中温育1小时至过夜； • 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱 色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料 呈白色为止。 • 观察结果。
敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。 • (4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的 检测。
常见的报告基因：
• 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有 以下几种： 常用的报告基因包括β—葡萄糖苷酸酶报告基因 (gus), 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基 因(ocs)、新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素乙酰 转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，βgalactosidase)、萤光素酶(luc，luciferase)、和 绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence protein)等.
• 常用的选择标记基因包括有抗生素抗性基 因和除草剂抗性基因（Bar 基因）。标记 基因通常与目的基因构建在同一表达载体 上，一起转入生物，但有时，标记基因本 身就是目的基因，如除草剂抗性基因。
• 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的 基因，也就是一个其表达物非常容易被鉴定 的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列 相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融 合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它 的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选 得到转化体。
实验八、转基因生物的GUS检测
实验目的：通过GUS(β- 葡萄糖苷酸酶)活性测定， 了解报告基因在基因工程中的应用。 要求：了解通过显色反应检验外源基因的表达情况 的方法，了解报告基因的概念。 技术应用：1. Gus基因与目的基因连接构建融合基 因进行组织定位； 2. gus基因与启动子连接来研究启动子的表达的组织 特异性。
材料： 转化的植物组织、器官、原生质体、
种子的胚及萌发的幼苗等。
非转化的相同材料（阴性对照）。
试剂： 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸酯 （X－Gluc） ；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton-
100； K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4
利用报告基因表达载体的研究技术的优点：
• 其一，避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基 因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录
活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响.
• 第二，易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性， 采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表
达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不
药品配方
• 1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺 (DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保 存于-20℃。 • 2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。 • 配制方法：50mM NaH2PO4· 0.78g/100ml；50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解； Na2EDTA （10mM， 372mg），Triton-100（0.1％，100μ l）, K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg） • 染色液：50μ l X-Gluc母液＋450μ l基液
具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容 易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技
术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。
gus基因简介
• gus基因是目前常用的一种报告基因，是β －D－ 葡 萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β -葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β －葡萄糖苷酸 ，它可以 将5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） 分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β -D葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简 单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。 • gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体 细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
• 报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于 判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功 能的研究实验中。
报告基因必须具备的条件
• (1)已被克隆和全序列已测定;
• (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被
转染的细胞中无相似的内源性表达产物;
• (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵
[Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
原理
• 适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶 （GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因 此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或 蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
相关知识链接——标记基因 • 标记基因是帮助对转基因生物体进行 筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标 记基因和报告基因。