细胞培养的教材.ppt

一、组织培养的基本概念

Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

体外培养

In Vitro

Tissue culture

Cell culture

Organ culture

细胞培养目的与用途

1、科学研究：药物研究开发与基础研究

(1) 新药筛选：(2) 疫苗研究与开发：(3) 基因工程药物研究与开发：(4) 细胞工程药物研究与开发：(5) 单克隆抗体制备：(6) 药物作用机理(6) 基因功能(7) 疾病发生机理

2、生物制药

(1) 疫苗生产：(2) 基因工程药物生产：(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产

(4) 细胞工程药物生产：

对组织培养的评价

优点：1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2、便于用各种不同技术方法研究细胞。

3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，广泛用于分子生物学和基因工程研究。

4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。

不足：利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞一样。

组织培养的发展简史

1、早期组织培养: Roux（1885）用温NS培养鸡胚。Jolly(1903)用盖片悬滴法培养蝾螈白细胞。Beebe and Ewing(1906)培养狗淋巴细胞。

2、现代组织培养：Harrison(1907) and Carrel(1912)开始，Harrison培养蛙胚神经组织。Carrel 培养了鸡胚心肌组织。

3 从50年代起，组织培养技术快速发展。试管培养

组织培养细胞生物学

一、体内外细胞的差异

“反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。

二、培养细胞的分化

1、不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）

2、脱分化或去分化（Dedifferentiation):细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）

培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。

细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。

培养细胞的形态分类

分为贴附型和悬浮型两大类

（一）贴附型

1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等

2、上皮型细胞

3、游走型细胞

4、多形型细胞

培养细胞的生长和增殖过程

（一）组织培养细胞生命期：原代培养期

传代期衰退期

原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。

传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。

细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。

无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。

克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。

克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.

（二）组织培养细胞一代生存期

1、潜伏期（Latent phase) :细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。原代培养细胞贴附慢（10-24 h）。连续细胞系贴附快（10-30 min)。

细胞贴附受多种因素影响

（1）支持物：底物表面要清洁，底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。

（2）一些特殊物质的存在：血清

2 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。

细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.

3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。

培养细胞生存环境、条件和代谢

一、无污染环境

二、温度：

三、气体环境和pH

四、培养细胞生存所需基本物质

1、糖

2、氨基酸

3、各种维生素

4、促生长因子* ：血清*

5、其他物质

五、渗透压

培养基*

合成培养基（Synthetic Medium)

天然培养基（Natural Medium)

血清，以牛血清和马血清为最常用。血清内含有多种促细胞生长因子，促贴壁因子及其它活性物质等。

一般需加10%-20%。

附着底物：

1、玻璃

2、一次性聚氯乙烯材料

3、饲细胞（Feeder cell)

用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。将特殊难培养的细胞接种于其上。

体外培养细胞成功率分析

成功的关键:培养物必须贴附在底物上

细胞生长和增殖

一、组织和细胞的供体年龄

二、培养条件

三、贴附底物

四、培养方法：酶消化分离

组织培养设施和基本条件

实验室设计

细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌。操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用设施及设备

（1）超净工作台：。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作

台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及

消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。

培养器皿

常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种

（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm

（4）培养板

培养用液

平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS)

天然培养基(Natural Medium)