细胞培养的教材.ppt

一、组织培养的基本概念Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

体外培养In VitroTissue cultureCell cultureOrgan culture细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究(1) 新药筛选：(2) 疫苗研究与开发：(3) 基因工程药物研究与开发：(4) 细胞工程药物研究与开发：(5) 单克隆抗体制备：(6) 药物作用机理(6) 基因功能(7) 疾病发生机理2、生物制药(1) 疫苗生产：(2) 基因工程药物生产：(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：对组织培养的评价优点：1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。

2、便于用各种不同技术方法研究细胞。

3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，广泛用于分子生物学和基因工程研究。

4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。

不足：利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞一样。

组织培养的发展简史1、早期组织培养: Roux（1885）用温NS培养鸡胚。

Jolly(1903)用盖片悬滴法培养蝾螈白细胞。

Beebe and Ewing(1906)培养狗淋巴细胞。

2、现代组织培养：Harrison(1907) and Carrel(1912)开始，Harrison培养蛙胚神经组织。

Carrel 培养了鸡胚心肌组织。

3 从50年代起，组织培养技术快速发展。

试管培养组织培养细胞生物学一、体内外细胞的差异“反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。

二、培养细胞的分化1、不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。

（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）2、脱分化或去分化（Dedifferentiation):细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。

细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。

培养细胞的形态分类分为贴附型和悬浮型两大类（一）贴附型1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等2、上皮型细胞3、游走型细胞4、多形型细胞培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。

细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。

细胞独立生存性差。

传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。

这一过程称为传代。

否则将影响细胞的继续生存。

细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。

无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。

核型大多变成异倍体。

克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。

克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.（二）组织培养细胞一代生存期1、潜伏期（Latent phase) :细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。

原代培养细胞贴附慢（10-24 h）。

连续细胞系贴附快（10-30 min)。

细胞贴附受多种因素影响（1）支持物：底物表面要清洁，底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。

（2）一些特殊物质的存在：血清2 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。

是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。

持续3-5天。

细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。

培养细胞生存环境、条件和代谢一、无污染环境二、温度：三、气体环境和pH四、培养细胞生存所需基本物质1、糖2、氨基酸3、各种维生素4、促生长因子* ：血清*5、其他物质五、渗透压培养基*合成培养基（Synthetic Medium)天然培养基（Natural Medium)血清，以牛血清和马血清为最常用。

血清内含有多种促细胞生长因子，促贴壁因子及其它活性物质等。

一般需加10%-20%。

附着底物：1、玻璃2、一次性聚氯乙烯材料3、饲细胞（Feeder cell)用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。

将特殊难培养的细胞接种于其上。

体外培养细胞成功率分析成功的关键:培养物必须贴附在底物上细胞生长和增殖一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件三、贴附底物四、培养方法：酶消化分离组织培养设施和基本条件实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。

细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。

细胞培养室的设计原则一般是无菌。

操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用设施及设备（1）超净工作台：。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。

操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。

缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。

培养器皿常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。

分直径30mm、60mm、120mm（4）培养板培养用液平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS)天然培养基(Natural Medium)合成培养基(Synthetic Medium)Hanks’平衡盐溶液（Hanks’Balanced Salt Solutions，HBSS）成分含量（g/L）CaCl2 (无水氯化钙) 0.14KCl 0.40KH2PO4 0.06MgCl2·6H2O 0.10MgSO4·7H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks天然培养基血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。

加热过程中須規則搖晃均勻。

此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量合成培养基一、种类RPMI1640：适用于很多细胞的生长，特别是血液细胞。

DMEM（Dulbecco’minimum essential medium) (高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。

HamF12 和Mc-Coy5A 多用于难培养的细胞。

合成培养基的成分：1、氨基酸2、碳水化合物3、维生素4、无机离子5其它成分：在杂交瘤技术中，常在DMEM培养基中加入2-巯基乙醇（2-Me). 2-Me对细胞的生长有非常重要的作用，能诱导细胞增殖。

常配成0.1M储存液，用时每升培养液加0.5ml. 培养液的配制1、玻璃三蒸馏水2、把干粉加入温（15-30度）水中，搅拌使其溶解；3、加NaHCO3;4、加水至终量5、用0.22 mm微孔滤膜滤过消毒。

消化液：分离组织和分散细胞。

常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液。

可以单独使用，也可以混合使用。

1）胰蛋白酶溶液胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。

胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。

一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。

胰酶溶液在pH8.0，温度为37℃时，作用能力最强。

注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。

因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡盐溶液配制成0.25%溶液。

胰蛋白酶溶液配制：（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。

胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。

保存条件：-20℃冰箱中，以免分解失效。

EDTA·4Na 溶液EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且毒性小。

常用工作液浓度为0.02%。

通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液）。

注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长。

EDTA 溶液配制：用无钙、镁的D-HBSS 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或4℃冰箱保存。

胰蛋白酶–EDTA·4Na 溶液（0.05%胰蛋白酶, 0.53mM EDTA·4Na）0.5g 胰蛋白酶＋0.2gEDTA·4Na＋1L D-HBSS。

-20℃冰箱中保存。

pH 调整液（1）NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。

配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4℃冰箱或室温保存。

当pH 值超过后，可用高压灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2 气体方法调节。

（2）HEPES（分子量238.31）溶液HEPES 使用终浓度一般为10-50 mM, 但通常配成1M 储存液：用200ml 双蒸水溶解47.6 克HEPES，用1N NaOH 调节pH 至7.5-8.0;然后过滤除菌，分装小瓶，室温或4℃保存。

青霉素100单位/ml培养液链霉素100 mg /ml培养液玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤（1）浸泡：需先用清水浸泡。

然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。