荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶：６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ） 底物： ６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖酸 Ｇ－６－ＰＤ
485nm
偏振光
产生强偏振荧光 485nm 偏振光 产生偏振荧光吗？
荧光偏振免疫分析的特征：
AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱;
AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强;
若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振 荧光弱; 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比。
485nm
偏振光
原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如
药物浓度）的检测。
原理：
光的本质是电滋波，光是各个方向电滋波的混合 物，当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方
向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平 面的偏振光（蓝色光，485nm）激发后，可吸收 光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量 并发射出单一平面的偏振荧光（绿色光，525nm ～550nm） 。
FPIA的评价：
操作简便：避免多次洗涤步骤；
快速：各物质混匀，孵育数分钟后即可测定；
环保；
有颜色和浑浊的溶液不干扰检测结果。
Hale Waihona Puke 时间分辨荧光免疫测定 荧光免疫测定分析技术：
检测体液中微量物质
荧光偏振免疫测定(FPIA)
定义：
荧光偏振免疫测定 (fluorescence polarization
immunoassay，FPIA)，为一种均相荧光免疫测
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法
荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。
【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。
随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。
基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。
一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。
溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。
虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。
荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。
对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。
荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。
由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。
荧光偏振免疫法测定血中依替米星的浓度
荧光偏振免疫法测定血中依替米星的浓度毛璐;卞婧;张威;甄健存【摘要】Objective: To develop the FPIA method to determine etimicin concentration in blood and investigate the feasibility of this method. Methods: The gentamycin test box was used to test the etimicin concentration by TDx. Results: The regression curve was Y= 0A39X + 0.177 2 (r= 0.998 1), and the linear relationship was good in range of 0.5 -20 ug·mL-1. The relative standard deviation was less than 10% for both intra-day and inter-day assay. The relative recovery for different concentrations were (93.12 ± 9.74)%, (102.41 ± 2.73)% and (89.50 ± 1.45)%, respectively. Conclusion: The FPIA method has high sensibility, easy operation and short test time. It can be used to determine blood concentration of etimicin in clinic.%目的:探索应用荧光偏振免疫法测定依替米星血药浓度的实验方法,考察该方法测定依替米星的可行性.方法:使用庆大霉素荧光偏振免疫试剂盒,用TDx对依替米星进行测定.结果:本方法能够检测依替米星的血药浓度,回归曲线为Y=0.439X+0.1772,r=0.9981,在0.5～20μg·mL-1,浓度范围内线性关系良好.日内、日间标准偏差均小于10%,低、中、高不同浓度的加样回收率分别为(93.12～9,74)%,(102.41～2.73)%,(89.50～1.45)%.结论:本方法灵敏度高,操作简便,检测时间短,可以用于临床快速检测依替米星的血药浓度.【期刊名称】《中国药物应用与监测》【年(卷),期】2011(008)005【总页数】2页(P282-283)【关键词】依替米星;浓度监测;荧光偏振免疫法【作者】毛璐;卞婧;张威;甄健存【作者单位】北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035【正文语种】中文【中图分类】R917硫酸依替米星系半合成氨基糖苷类抗生素，是我国自行研制的I类新药，其抗菌谱广、抗菌活性强、抗交叉耐药性好，且耳、肾毒性远低于其他氨基糖苷类抗生素，可以用于耐庆大霉素菌株，即产氨基糖苷类钝化酶菌株的感染[1]。
荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康.特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1。
1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上.1。
2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1。
3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
荧光偏振免疫法测定环孢素A全血浓度的若干问题分析
２ ０・ ９
第２ ８卷 第 ３ 期 ２１ ０ ０年 ６月
实 验 与 检 验 医 学
Ｅ ＥＲ ＭＥＮ ＡＬ ＸＰ Ｉ Ｔ ＡＮＤ ＬＡ ＲＡＴ Ｂ０ ０ＲＹ ＭＥＤＩ Ｉ Ｃ ＮＥ
Ｖ０ ．８ Ｎｏ３ １ ． ２
Ｊｎ ２ １ ｕ．００
・
经验 交流 ・
荧光偏 振免疫 法测定环孢 素 Ａ全血浓度 的若 干 问题分析
邹德 琴 ， 魏筱 华 ， 雪 莲 郑
（ 昌大 学 第 一 附属 医 院药 剂 科 ， 西 南 昌 ３ ０ ０ ） 南 江 ３０ ６
中图分类号 Ｒ ４ ．１ ，４ ６ １ ４ ６１＋ １ ４ ． ２ ／ ６
文献标 识码 Ｂ
文章编号 １７ — ９２ ｌ）３ ０ ９ － １ ６ ４ １２ （Ｏ ｏ０ — ２ ０ ０ １
题 进行 分 析 １ 材 料 与 方 法
表 １ 我院 ２ ０ ０ ３年 ３月～ ０ ０年 ２月荧光偏振免疫法 ２１
测 定 ＣＡ 全 血浓 度 失 败 １ ｓ ５次 出现 的 问 题
１ 材 料 Ｔ ｘ Ｔ 析 仪 ， 心 机 ． 旋 混 合 器 。 ｓ 试 剂 ． １ Ｄ ＦＪ ｘ分 离 涡 ＣＡ
盒 ，ｓ Ｃ Ａ标 准 品 ， ｓ Ｃ Ａ质 控 ， 为美 国 Ａ ｂｔ公 司生 产 。 都 ｂ ｏｔ
１ 操 作 方 法 ． ２
３ 讨 论
从 表 １可 看 出 。 带 断 裂 是 最 常 出 现 的 问 题 ． 带 断 裂 皮 皮 必须 更 换 皮 带 ． 进 行 光 路 检 查 和 吸 量 检 查 ． 保 Ｔ ｘ ｋ 校 并 确 ＤＦ
测 ， 失 败 ， 光 路 定 标 ， 失 败 就 必 须 换 灯 泡 。灯 泡 出 问题 如 做 再
荧光偏振免疫分析PPT
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓 度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲 且有弹性此构型对应着一定的偏振度值. 在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光 偏振度在0.11左右;
• 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非 特异性结合),背景荧光和光散射的影响。
• 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围 (窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。
• 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需
对本实验室研究的思考
• 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋 白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标 签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数, 动力学白分子可能呈现更紧密、更小 的构型, 导致复合体分子
荧光偏振研究的一般步骤
• 1.确定最佳的荧光标记物;
• 2.确定公式中的各种参数;
• 3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定 最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性 关系;
• 4.建立标准曲线;
• 而待测样本中竞 争抗原的浓度增 加时,荧光标记抗
• FPIA是均相的 竞争免疫分析方 法,反应完全在 溶液系统中,不 需要分离结合的 和未结合的抗体。
• 实验操作过程非 常简单,仅仅是 将抗体,荧光标
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比为10:1;
荧光偏振免疫分析的优点
• 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂 的用量。
荧光偏振免疫测定原理
荧光偏振免疫测定原理荧光偏振免疫测定是一种高灵敏度、高选择性的生物分析技术，被广泛应用于医学、生物学和环境监测等领域。
该技术的原理基于免疫反应和荧光偏振现象，通过对待测物体系中特定分子的选择性捕获和荧光信号检测，实现对目标物质的快速、准确测定。
荧光偏振免疫测定的原理可分为三个关键步骤：免疫反应、荧光标记和偏振信号检测。
首先，免疫反应是荧光偏振免疫测定的基础。
它依赖于抗原与抗体之间的高度特异性结合。
抗原是待测物体系中所含有的分析目标，抗体则是针对特定抗原的免疫分子。
在荧光偏振免疫测定中，抗原首先被固定在试验平台上，形成固相。
然后，待测样品中的抗原与试验平台上的抗体进行结合反应。
这种特异性结合反应仅发生在目标物质存在的情况下，因此可以使用免疫反应来筛选目标物质并排除其他干扰物质。
接下来，荧光标记是实现荧光信号检测的关键步骤。
它利用特定的荧光染料或荧光颗粒，将其标记在反应中与目标物质结合的抗体或其他特定分子上。
这些荧光标记物可以发射特定波长的荧光信号，并具有较长的发光寿命。
荧光标记物的选择应考虑到其荧光性能，例如荧光量子产率和发射波长尽可能远离样品中其他自发荧光的波长，以避免干扰信号。
荧光标记物的引入使得待测物体系具有荧光特性，从而可以通过检测荧光信号来实现分析和测定。
最后，偏振信号检测是荧光偏振免疫测定的核心。
它利用了光波振动方向的偏振特性。
在荧光偏振免疫测定中，通过选择适当的偏振器和荧光探测器，可以将荧光信号从样品中提取出来，并测量相对应的荧光偏振参数。
荧光偏振参数是由样品中荧光分子的取向、偏振或了解以及其与固相之间的相互作用所决定的。
这些参数可以提供关于待测物体系中分子间相互作用的信息，因此能够准确测定特定目标物质的含量。
总之，荧光偏振免疫测定通过免疫反应、荧光标记和偏振信号检测等关键步骤，实现对目标物质的高灵敏度、高选择性测定。
这种技术不仅具有广泛的应用前景，而且对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义，能够帮助人们更好地理解分子间的相互作用以及其在生物体系中的功能和调控机制。
雌二醇荧光偏振免疫分析方法试验方案-修改
雌二醇荧光偏振免疫分析方法试验方案1.雌二醇半抗原的合成方法：将150 mg(0.55 mmol) E2（258.36g/mol）溶于3 mL 干燥的二甲基亚砜中, 加入0.5 g(9 mmol) KOH粉末。
搅拌5 min后加入150 mg (1.07 mmol)溴乙酸。
继续搅拌, 反应2 h后加入25 mL冰水。
乙酸乙脂萃取回收未反应的E2。
水相用2 mol/L HCL 酸化, 出现白色沉淀。
砂芯漏斗过滤, 沉淀物用蒸馏水洗至中性, 放入烘箱干燥，得白色沉淀（记录质量）。
点板监控，用乙酸乙酯：石油醚=3：2（加1滴冰乙酸）的展开剂比例。
从结构上可以看到有一个羧基暴露，所以可以考虑将荧光素衍生出一个氨基，使其两者可以结合。
2. 对荧光素进行衍生2．1 中间产物异硫氰酸荧光素乙二胺fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine(EDF)的合成反应式见图：图. EDF合成过程Figure. The synthesis of EDF具体步骤：（1）配制甲醇三乙胺溶液，三乙胺浓度为10mL/L。
（2）将20 mg（0.3 mmol）(70ul) 乙二胺和11.7mg（0.03mmol）FITC，分别溶于5mL甲醇三乙胺溶液和1mL甲醇三乙胺溶液中。
（3）将FITC溶液逐滴(约每30秒一滴)加到三乙胺溶液中，室温(室温产率很低，请尝试40度水浴或油浴)避光搅拌反应，刚投料后TLC监控一次（用稀FITC溶液作对照，以后每次都是），随后每隔30 min TLC监测一次，直至FITC点消失。
（4）旋转蒸发浓缩反应液（旋干！！之后在烘箱烘30 min！！非常重要），用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝3:1展开，观察有新物质产生。
（5）装一个短而粗的层析柱，用纯的乙酸乙酯冲洗50 mL，换成乙酸乙酯:甲醇＝3:1冲洗，待下边黄色FITC带下来后，用甲醇冲洗柱子，收集滤液浓缩即得纯化EDF，得到粉末状的EDF；或者不用甲醇冲，直接色谱柱最上层红黄色带刮下来，放入离心管用甲醇震荡冲洗，离心收集上清，反复冲洗离心3-5次，合并上清。
荧光偏振免疫法
荧光偏振免疫法荧光偏振免疫法是一种常用的生物分析技术，可以用于检测和分析样品中的特定分子。
本文将介绍荧光偏振免疫法的原理、应用以及优缺点。
一、原理荧光偏振免疫法是基于荧光技术和免疫学原理的结合。
它利用特异性抗体与目标分子结合的能力，通过荧光标记的抗体来检测和定量目标分子。
荧光偏振免疫法的原理可以简述为以下几个步骤：首先，将样品中的目标分子与特异性抗体进行反应，形成抗原-抗体复合物。
然后，通过加入荧光标记的二抗或酶标记的二抗，使荧光物质或酶物质与抗原-抗体复合物结合。
最后，通过荧光偏振光谱仪或酶标仪来检测和测量荧光强度或酶的活性，进而定量目标分子的含量。
二、应用荧光偏振免疫法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 肿瘤标记物检测：荧光偏振免疫法可以检测和定量血清中的肿瘤标记物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）等，用于早期癌症的筛查和诊断。
2. 免疫组织化学：荧光偏振免疫法可以用于定位和定量组织中的特定蛋白或细胞表面标记物，如免疫组织化学染色和免疫组织化学定位。
3. 免疫荧光显微镜：荧光偏振免疫法可以用于细胞和组织的观察，通过荧光偏振显微镜观察荧光信号的方向和强度，可以获得更多的信息，如蛋白的空间分布、蛋白的定位等。
4. 荧光免疫分析：荧光偏振免疫法可以用于定量检测样品中的特定分子，如激素、细胞因子等。
通过测量荧光强度和方向，可以实现高灵敏度和高特异性的分析。
三、优缺点荧光偏振免疫法具有以下优点：1. 高灵敏度：荧光偏振光谱仪可以测量荧光信号的强度和方向，提高了测量的灵敏度。
2. 高特异性：荧光偏振免疫法利用特异性抗体与目标分子结合，具有高特异性，可以准确检测目标分子。
3. 高通量：荧光偏振免疫法可以同时检测多个目标分子，提高了检测效率。
4. 定量分析：荧光偏振免疫法可以通过测量荧光强度或酶活性来定量目标分子的含量。
然而，荧光偏振免疫法也存在一些缺点：1. 荧光标记的抗体易受到光照和温度的影响，可能导致荧光信号的变化。
荧光偏振免疫分析法在小分子药物小鼠血药浓度检测中的应用
荧光偏振免疫分析法在小分子药物小鼠血药浓度检测中的应用刘洋;刘艳;刘宸辛;冯志桐;姜丹【摘要】目的:建立应用荧光偏振免疫分析法(FPIA)测定小鼠血药浓度的实验方法,探讨该方法测定庆大霉素、地高辛和丙戊酸钠3种常见小分子药物小鼠血药浓度的可行性.方法:选用庆大霉素、地高辛和丙戊酸钠标准品,采用荧光偏振(FP)值非线性拟合法确定药物检出限及线性范围,在线性范围内分别设置低、中和高3个浓度组,检测质控偏差、日间精密度和小鼠血清干扰水平.选用30只KM小鼠进行药物代谢曲线测试,分为庆大霉素组(肌肉注射5μg·g-1)、地高辛组(灌胃20 ng·g-1)和丙戊酸钠组(灌胃15μg·g-1),每组10只,给药后24 h内取5个时间点(1、3、6、12和24 h)测定小鼠血药浓度.结果:FPIA法检测3种药物的检出限均在50μg·L-1以下,线性范围较宽(大于10倍检出限),检测质控误差小于5％,日间精密度较高[中和高浓度组变异系数(CV)<5％],小鼠血清对庆大霉素和地高辛的检测效果无明显影响[误差百分比(ER)<5％],高浓度血清对丙戊酸钠的检测效果有一定的负向影响(50％血清组ER为-12.84％).小鼠给药1 h后庆大霉素达到血药浓度峰值,半消期3h;1h后地高辛达到血药浓度峰值,半消期>24h;3h后丙戊酸钠达到血药浓度峰值,半消期6～12 h.结论:FPIA法测定小分子药物小鼠血药浓度所需样本量小,精确度高,前处理简单,具有高通量和快速检测的优势特点,可广泛应用于药理学、药剂学和临床检测研究中.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】6页(P833-838)【关键词】荧光偏振免疫分析;血药浓度;庆大霉素;地高辛;丙戊酸钠【作者】刘洋;刘艳;刘宸辛;冯志桐;姜丹【作者单位】吉林大学生命科学学院,吉林长春 130021;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130021;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130021;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130021;吉林大学生命科学学院,吉林长春 130021【正文语种】中文【中图分类】R969.1小鼠是药物和疾病模型中常用的模式生物，对小鼠给药后的血药浓度准确监测是药理和药剂学研究中必须解决的技术难题之一。
荧光偏振免疫分析PPT课件
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
Source: Information Dynamics 2000
AxSYM 分析项目的发展
▪ 目前在AxSYM上可提供的项目有超过80项 ▪ 使用的技术有MEIA, FPIA, Ion Capture和REA
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶：６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ） 底物： ６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖酸
Ｇ－６－ＰＤ
甲状腺功能 三碘甲状腺原氨酸 甲状腺素 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺素 超敏促甲状腺素 促甲状腺素 3.0 甲状腺摄取 抗-TPO 抗-Tg PTH
生殖/内分泌 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 催乳素 睾酮
心血管急诊 肌酸激酶(MASS) 心肌钙蛋白-I 心肌红蛋白 同型胱胺酸酸 BNP
J&J
Mar. 2003 AxSYM/
Centaur/
i2000/i2000 sr
ACS180
美国
4000+/100+/ >800/>700 100+
Access/ Access 2
>1500/>25 0
Immulite/
Immulite 2000/100
大田软海绵酸荧光偏振免疫分析方法研究
近年 来 随着世 界经 济 和工业 发展 ， 量废 弃 物 大
排 人 近海 ， 导致海 水 富营养 化 ， 引起 藻类 过度 繁殖 ， 形 成 赤潮 ， 于是 有 些 藻类 能 产 生生 物 毒 素 ， 贝类 摄
（ＰＡ） 一种 均相 荧光 免疫 分析 方法 ， 有实 验操 ＦＩ 是 具 作 简单 、 品通 量高 、 本低 、 速 、 样 成 快 可靠 等优点 。本
福 建 分 析测 试
Ｆｊ ｎＡ ａ ｓ ＆ Ｔ ｓｎ ｕｉ ｎｌ ｉ ａ ｙ ｓ ｅｔ ｇ ｉ
９
大 田软海 绵 酸 荧 光偏 振 免 疫 分析 方 法研 究
龙再浩 ， 谭 曜， 陈小青 ， 中春 马
宁波 ３５ １ ） １０ ２
（ 宁波 出入 境检验 检疫局 。 浙江
摘
要： 设计使用荧光试剂Ｐ Ａ Ｄ Ｍ与大 田软海绵酸单（ Ａ） Ｏ 反应合成 了荧光标记物 ， 并在Ｏ 单克隆抗体的基础上建立 Ａ
基金 项 目 ： 江省 分 析测 试 科 技计 划 项 目（０ ９ ７ ０ ２ 浙 ２０ Ｆ０ １ ）
Ｐ７ ） Ｈ ． 用于抗体 、 ４ 示踪物和标准品稀释， 固相萃 ｃ
取 柱（ ０ ｍ ， ｔｒ ５ ０ ｇ Ｗａ 公司 ） ｅ 。 １２ 示踪物 ＯＡ Ｐ Ａ ＿ — Ｄ Ｍ的合成和 纯化
能诱 导摄食 者 出现腹泻 、 呕吐及 胃肠 绞痛 等 急性 胃 肠 炎 ， 且有 促肿 瘤效 应 。 目前 国 内外报 道 检测腹 并
酸（ｉ 公 司 ）大 田软海 绵酸 单克 隆抗体 （ｏａａ Ｓｇ ｍａ ， Ｃ ｖｌ ｂ 公 司 ）Ｐ Ａ （ｌｋ 司 ） ，Ｄ Ｍ Ｆｕａ公 ，磷 酸 盐缓 冲液 （Ｂ ， Ｐ Ｓ
将 较 高 。如果 检 测样 品 中含 有待 检测 物 质 ， 与荧 则 光 示踪 物 竞争 抗 体位 点 ， 这样 未 结合 状 态荧 光示 踪 物量将 显著增 加 ，Ｐ值 就会 降低 。 Ｆ ＦＩ ＰＡ相对 于其它 免疫方 法相 比有 许 多优点 ［］ ５。 － ６
荧光偏振免疫分析ppt课件
1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂的用量。
2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛选检测。
3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期保存,方法的重现性好。
4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,不易受溶液颜色和仪器灵 敏度变化的影响，实验结果稳定,可靠性高。
荧光偏振免疫分析的缺点
1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般来说FPIA的检测限为 0.1-10ng/mL-1左右。
2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非特异性结合),背景荧光 和光散射的影响。
3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围(窗口)较窄,信噪比 (S/N)较低。
4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需耍较复杂的纯化步骤。
认识到了贫困户贫困的根Байду номын сангаас原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“精 准扶贫 ”项目
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
2.荧光偏振度测量:
用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏振度测量模式;
在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自动设置在半波长模 式, 这样激发光在水平分量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“精 准扶贫 ”项目
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲且有弹性此构型对应着 一定的偏振度值.在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光偏振 度在0.11左右;
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“精 准扶贫 ”项目
荧光偏振分析方法
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 小分子检测
蛋白质增强荧光偏振
单 链 结 合 蛋 白 SSBP (Single-strand binding proteins）
Anal. Chem. 2012, 84, 7203-7211.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
➢ 离子检测
特殊结构核酸增强荧光偏振
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54, 285-291.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Chem. Asian J. 2014, 9, 87-92.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
非竞争法检测小分子化合物
空间构象变化
Anal. Chem. 2009, 81, 7468-7473.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
5. 小分子分析
磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台
Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 3229-3234.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料
与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量 和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有 潜在的应用价值。
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。
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FPIA是均相的竞争免疫 分析方法,反应完全在溶 液系统中,不需要分离结 合的和未结合的抗体。
实验操作过程非常简单, 仅仅是将抗体,荧光标记 的抗原和抗原加入到反应 杯中,经过几分钟甚至是 几秒钟的温育便可直接测 量,很快得到被测抗原的 浓度。
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
1. 制备DNA-组蛋白复合体:
5.选用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测,可实现多目标物的同 时定性及定量分析。如四甲基罗丹明,其激发和发射光谱与荧光素的重 叠很少,因此相互之间基本不会干扰,现已在多标记检测中得到应用。
荧光偏振免疫分析的缺点
1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般来说FPIA的检测限为 0.1-10ng/mL-1左右。 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非特异性结合),背景荧光 和光散射的影响。 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围(窗口)较窄,信噪比 (S/N)较低。 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需耍较复杂的纯化步骤。 5. FPIA检测需要特定的分析仪器,或对普通的荧光分光光度计增 加测量偏振附件。因此价格较普通酶标仪昂贵。
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子 之比为10:1; 用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH≈6.6)稀释组蛋白溶液; 组蛋白浓度是DNA的10~500倍;
DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后的组蛋白溶液共同 保温(37℃)培育3h, 反应液体积为2mL;
对本实验室研究的思考
当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋白时，可以在 核酸的末端加上一个荧光标签,研究二者之间的结合关系,包 括结合常数,动力学参数等等。
推而广之，还通过核 酸等小分子研究蛋白 -蛋白复合物之间的 结合。
荧光偏振免疫分析的优点
1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂的用量。
2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛选检测。
3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期保存,方法的重现性好。 4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,不易受溶液颜色和仪器灵 敏度变化的影响，实验结果稳定,可靠性高。
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
2.荧光偏振度测量:
用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏振度测量模式;
在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自动设置在半波长模 式, 这样激发光在水平分量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换; 应用Bio-Kine 软件(Bio-Logic)通过两个散射信号实时计 算荧光强度和荧光偏振度;
荧光偏振免疫分析
---by沈未
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荧光偏振(fluorescence polarization, FP)通常 定义为:用垂直方向(丄)的偏振光激发荧光分子,然后 测量发射偏振光在垂直方向(丄)和水平方ห้องสมุดไป่ตู้(丨)的荧 光光强度(丨)
早期的荧光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于临床 化学和药物筛选;而A多生物学检测,是因其便于进行数 据分析和解释某些相关的物理学参数。
在组蛋白的作用下，DNA分子发生了凝聚; DNA-组蛋白分子可能呈现更紧密、更小的构型, 导致复合体分子 比 DNA 分子旋转更快, 对应较小的荧光偏振度值;
荧光偏振研究的一般步骤
1.确定最佳的荧光标记物; 2.确定公式中的各种参数; 3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定最优稀释比，使 其结合能力与FP值成线性关系; 4.建立标准曲线; 5.分析结果,验证实验猜想。
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲且有弹性此构型对应着 一定的偏振度值.在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光偏振 度在0.11左右;
FP值是一个比值,一般 以mP表示 (1P=1000mP)。 分子固定不动,即完全 偏振时,FP值是 P0=1000 mP,是理 论上的最大值; 在一个分子可以自由 运动的系统中,根据分 子运动速度的快慢,荧 光偏振值大约在0~ 500 mP之间.
论文的结构和主要内容
如果待测样本中竞争抗原 含量很少(低于检测限),荧 光标记抗原与抗体结合,FP 值较高(一般在150-300 mP)。 而待测样本中竞争抗原的 浓度增加时,荧光标记抗原 以游离的形式存在于样本 中,FP值便会下降,一般在 30-60 mP即为完全抑制