荧光偏振免疫分析PPT
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
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2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
免疫检验自动化仪器分析PPT(共95页)【95页】
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成。
(三)速率散射比浊法（rate nephelometry）
(二)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
1. 仪器测定技术要点
(1) 抗原抗体预反应阶段 (2) 反应阶段(3) 信号检测
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
（二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
第一节 自动化免疫浊度分析系统
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2min即可完成。
(三)速率散射比浊法（rate nephelometry）
(二)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
1. 仪器测定技术要点
(1) 抗原抗体预反应阶段 (2) 反应阶段(3) 信号检测
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
（二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
第一节 自动化免疫浊度分析系统
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
荧光偏振分析方法课件
Nucleic Acids Res. 2003, 31: e70.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
“signal-off” “signal-on”
Anal. Chem. 2013, 85, 1424-1430.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法
Materials Science and Engineering C 2014, 38, 206-211.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料
与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量 和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有 潜在的应用价值。
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化
§6.22 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法
ChemBioChem 2010, 11, 494-497.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
二氧化钛纳米棒增强荧光偏振信号分析方法
Acta Chim. Sinica 2013, 71, 1620-1624.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
核酸酶检测及药物筛选
Chem. Commun. 2011, 47, 4763-4765.
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
4. 水解酶催化反应
实时监测蛋白酶催化过程
• 蛋白酶对机体的新陈代谢 和生物调控起到非常重要 的作用；
• 蛋白酶酶活的评估有助于 理解特定的生化途径、开 发治疗药物。
Chem. Rev. 2010, 110, 2685-2708.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
“signal-off” “signal-on”
Anal. Chem. 2013, 85, 1424-1430.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法
Materials Science and Engineering C 2014, 38, 206-211.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米材料
与蛋白质和核酸相比，纳米材料具有良好的热稳定性、更大的质量 和体积且易于合成和进行表面修饰，因此用纳米材料增强荧光偏振具有 潜在的应用价值。
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化
§6.22 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
纳米球形聚电解质刷增强荧光偏振信号分析方法
ChemBioChem 2010, 11, 494-497.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
二氧化钛纳米棒增强荧光偏振信号分析方法
Acta Chim. Sinica 2013, 71, 1620-1624.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
核酸酶检测及药物筛选
Chem. Commun. 2011, 47, 4763-4765.
荧光偏振免疫分析
优势
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
荧光偏振免疫分析具有高灵敏度、高特异性和低检测限等优点，能够实现快速、准确地定量检测目标 物质。此外，该技术还具有操作简便、样本用量少等优点，使得其在生物医学领域中具有广泛的应用 前景。
02
荧光偏振免疫分析技术
荧光物质与标记技术
荧光物质
荧光物质是一种能够在特定波长光激发下发出荧光的物质，常用于荧光偏振免疫 分析中的标记物。常见的荧光物质包括荧光素、量子点、荧光染料等。
数据处理
数据处理是对检测到的信号进行解析、计算和分析的过程。通过建立数学模型和算法，将荧光信号转化为待测物 质的浓度或活性。数据处理还包括对实验数据的统计、分析和可视化，以提供准确的实验结果和可靠的结论。
荧光偏振免疫分析的优缺点
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、可 定量检测等。
缺点
对实验条件要求较高、仪器设备昂贵 、需要专业操作人员等。
通过病毒与细菌检测，有助于疾病的早期诊断、治疗监测和预防控制，对于公共卫生和疫情防控具有 重要意义。
其他医学应用
荧光偏振免疫分析在医学诊断中还有 许多其他应用，如药物浓度监测、自 身免疫性疾病的抗体检测、生物毒素 和毒素抗体的检测等。
通过这些应用，可为临床医生提供更 全面的诊断信息，有助于疾病的精准 治疗和患者管理。
100%
数据记录
记录荧光信号的变化，生成数据 曲线或表格。
80%
结果分析
根据数据曲线或表格，计算抗原 的浓度或活性，进行结果解读和 报告。
04
荧光偏振免疫分析在医学诊断中的应用
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物是肿瘤细胞分泌或脱落到体液中的物质，可用于肿瘤 的早期发现、诊断、治疗监测和预后评估。荧光偏振免疫分析可 以检测体液中微量肿瘤标志物，为肿瘤的早期发现和治疗提供有 力支持。
荧光免疫试验课件
3、寄生虫感染的诊断
4、白细胞分化抗原的检测
5、人类白细胞抗原的检测
6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测 7、激素和酶的组织定位
肿瘤（人肝癌细胞 ）
现在学习的是第45页，共53页
二、其他荧光免疫试验
（一）时间分辨荧光免疫 试验
1.内分泌学中的应用
2.肿瘤学中的应用
3.免疫学中的应用
4.分子生物学的应用
5.微生物学中的应用
现在学习的是第11页，共53页
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
最大吸收光 谱
最大发射光谱
490～ 495nm
520～530nm （黄绿色）
570～ 575nm
595～600nm （橙红色）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧 系元素特异荧光
现在学习的是第30页，共53页
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
②阴对：阴性血清+荧光标记物 ③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3.标本片需保持湿润，避免干燥
4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本上
现在学习的是第25页，共53页
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。
++ ：荧光明亮。
+++：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或
4、白细胞分化抗原的检测
5、人类白细胞抗原的检测
6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测 7、激素和酶的组织定位
肿瘤（人肝癌细胞 ）
现在学习的是第45页，共53页
二、其他荧光免疫试验
（一）时间分辨荧光免疫 试验
1.内分泌学中的应用
2.肿瘤学中的应用
3.免疫学中的应用
4.分子生物学的应用
5.微生物学中的应用
现在学习的是第11页，共53页
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
最大吸收光 谱
最大发射光谱
490～ 495nm
520～530nm （黄绿色）
570～ 575nm
595～600nm （橙红色）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧 系元素特异荧光
现在学习的是第30页，共53页
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
②阴对：阴性血清+荧光标记物 ③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3.标本片需保持湿润，避免干燥
4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本上
现在学习的是第25页，共53页
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。
++ ：荧光明亮。
+++：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或
荧光偏振免疫分析PPT课件
0
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
Source: Information Dynamics 2000
AxSYM 分析项目的发展
▪ 目前在AxSYM上可提供的项目有超过80项 ▪ 使用的技术有MEIA, FPIA, Ion Capture和REA
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶：６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ） 底物： ６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖酸
Ｇ－６－ＰＤ
甲状腺功能 三碘甲状腺原氨酸 甲状腺素 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺素 超敏促甲状腺素 促甲状腺素 3.0 甲状腺摄取 抗-TPO 抗-Tg PTH
生殖/内分泌 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 催乳素 睾酮
心血管急诊 肌酸激酶(MASS) 心肌钙蛋白-I 心肌红蛋白 同型胱胺酸酸 BNP
J&J
Mar. 2003 AxSYM/
Centaur/
i2000/i2000 sr
ACS180
美国
4000+/100+/ >800/>700 100+
Access/ Access 2
>1500/>25 0
Immulite/
Immulite 2000/100
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
Source: Information Dynamics 2000
AxSYM 分析项目的发展
▪ 目前在AxSYM上可提供的项目有超过80项 ▪ 使用的技术有MEIA, FPIA, Ion Capture和REA
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶：６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ） 底物： ６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖
６－磷酸葡萄糖酸
Ｇ－６－ＰＤ
甲状腺功能 三碘甲状腺原氨酸 甲状腺素 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺素 超敏促甲状腺素 促甲状腺素 3.0 甲状腺摄取 抗-TPO 抗-Tg PTH
生殖/内分泌 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 催乳素 睾酮
心血管急诊 肌酸激酶(MASS) 心肌钙蛋白-I 心肌红蛋白 同型胱胺酸酸 BNP
J&J
Mar. 2003 AxSYM/
Centaur/
i2000/i2000 sr
ACS180
美国
4000+/100+/ >800/>700 100+
Access/ Access 2
>1500/>25 0
Immulite/
Immulite 2000/100
荧光偏振免疫分析PPT课件
↓ 冲洗管路
↓ 探针内部清洗
↓ 样品检测
第44页/共55页
仪器的关闭
探针内部清洗 ↓
关机
第45页/共55页
AxSYM日常保养
第46页/共55页
每周保养
探针外部清洗 ↓
冲洗站清洗 ↓
1,３号注液器清洗 ↓
清洁过滤网
第47页/共55页
每周保养
↓ FPIA和MEIA的光路检查
↓ 清洁样品篮和样品管托架
第23页/共55页
系统控制中心
• 样品/测试放置清单 • 结果浏览 • 报告/选择结果 • 动态时间显示和批处理结果 • 病人结果打印 • 结果保存和归档 • 定标浏览 • Levey Jennings 质控图 • 库存监控 • 自动 “菜单操做保养”
第24页/共55页
纤维杯容器
玻璃纤维杯用于MEIA方法 的微粒子捕捉
>1500/>25 0 >2500/>12 5
DPC Immulite/ Immulite 2000/100 --/--/100
>5000/>200 0/200
J&J Vitros ECi
Roche
2010/1010/ E170
->1000
600/200/50
4000/2000/ 300
20000
18000 16000 14000 12000 10000
5000 4000 3000 2000 1000
0
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
↓ 探针内部清洗
↓ 样品检测
第44页/共55页
仪器的关闭
探针内部清洗 ↓
关机
第45页/共55页
AxSYM日常保养
第46页/共55页
每周保养
探针外部清洗 ↓
冲洗站清洗 ↓
1,３号注液器清洗 ↓
清洁过滤网
第47页/共55页
每周保养
↓ FPIA和MEIA的光路检查
↓ 清洁样品篮和样品管托架
第23页/共55页
系统控制中心
• 样品/测试放置清单 • 结果浏览 • 报告/选择结果 • 动态时间显示和批处理结果 • 病人结果打印 • 结果保存和归档 • 定标浏览 • Levey Jennings 质控图 • 库存监控 • 自动 “菜单操做保养”
第24页/共55页
纤维杯容器
玻璃纤维杯用于MEIA方法 的微粒子捕捉
>1500/>25 0 >2500/>12 5
DPC Immulite/ Immulite 2000/100 --/--/100
>5000/>200 0/200
J&J Vitros ECi
Roche
2010/1010/ E170
->1000
600/200/50
4000/2000/ 300
20000
18000 16000 14000 12000 10000
5000 4000 3000 2000 1000
0
Instrument Placements
AxSYM RxL HM ACS 180
Access Immuno 1 Elecsys 2010 Immulite 2000
Centaur ECI
荧光免疫技术(免疫学检验课件)
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
荧光抗体的制备
制备免疫血清 亲和层析
离子交换层析法
纯化抗体荧光素 搅拌法
标记抗体
透析法
纯化
透析法 凝胶过滤法
鉴定
实际应用
第二节 荧光免疫显微技术
荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原结 合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下 观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部 位。
定性和定位检测，或对自身 抗体进行定性和滴度测定
四、临床应用
广泛用于微量或超微量物质的检测， 如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类 固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤 标记物及病毒抗原等的测定。
第四节 荧光偏振免疫测定
（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出 单一平面的偏振荧光的现象。
进入物镜。
落射光：照明光
线从标本上方落
射到标本上，经
反射进入物镜。
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
荧光抗体的制备
制备免疫血清 亲和层析
离子交换层析法
纯化抗体荧光素 搅拌法
标记抗体
透析法
纯化
透析法 凝胶过滤法
鉴定
实际应用
第二节 荧光免疫显微技术
荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原结 合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下 观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部 位。
定性和定位检测，或对自身 抗体进行定性和滴度测定
四、临床应用
广泛用于微量或超微量物质的检测， 如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类 固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤 标记物及病毒抗原等的测定。
第四节 荧光偏振免疫测定
（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出 单一平面的偏振荧光的现象。
进入物镜。
落射光：照明光
线从标本上方落
射到标本上，经
反射进入物镜。
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
(10检本)第七章-荧光免疫技术PPT课件
• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经 标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
31
第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
-
• (E)
-
49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
-
50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
-
20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
-
21
二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
-
22
试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
-
23
返回
-
24
-
25
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
31
第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
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• (E)
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49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
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50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
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20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
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二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
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22
试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
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23
返回
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24
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25
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)
荧光偏振分析方法
碳基纳米材料：石墨烯，碳纳米管，碳纳米颗粒等
与DNA发生π-π堆积作用 与多肽发生π-π静电作用等
ssDNA/dsDNA与碳基纳米材 料之间的相互作用差别悬殊
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法
Chem. Commun. 2013, 49, 1942-1944.
荧光偏振免疫分析原理
§6.1 传统荧光偏振技术及发展情况概述
1. 荧光偏振免疫分析
近年来，FPIA备受生物、化学、医学专家们的亲睐，有关FPIA在临床化 学、农药残留分析、食品安全、环境监测中应用的报道逐年增加，成为生化分 析和环境监测中强有力的工具。
➢ 优点：均相分析无需分离、迅速、灵敏、无放射性污染、重现性高；
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54, 285-291.
§6.2 纳米增强荧光偏振一般策略及应用
碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法
Chem. Asian J. 2014, 9, 87-92.
第6章荧光偏振分析方法传统荧光偏振技术及发展情况概述1纳米增强荧光偏振一般策略及应用261传统荧光偏振技术及发展情况概述光的偏振性非偏振光原理图偏振光原理图自然光在各个方向振动是均匀分布的一束光线都在同一方向上振动荧光偏振fluorescencepolarizationfp1926年perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象
• 通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。
荧光偏振技术的优势:
荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 (特别是 不生成有害的放射性废物) 并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光 偏振是真正均相的，允许实时检测 (动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均 相检测形式 (中间不含洗涤步骤 ) 的最佳解决方案。
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应用Bio-Kine 软件(Bio-Logic)通过两个散射
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓 度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲 且有弹性此构型对应着一定的偏振度值. 在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光 偏振度在0.11左右;
• 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非 特异性结合),背景荧光和光散射的影响。
• 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围 (窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。
• 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需
对本实验室研究的思考
• 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋 白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标 签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数, 动力学白分子可能呈现更紧密、更小 的构型, 导致复合体分子
荧光偏振研究的一般步骤
• 1.确定最佳的荧光标记物;
• 2.确定公式中的各种参数;
• 3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定 最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性 关系;
• 4.建立标准曲线;
• 而待测样本中竞 争抗原的浓度增 加时,荧光标记抗
• FPIA是均相的 竞争免疫分析方 法,反应完全在 溶液系统中,不 需要分离结合的 和未结合的抗体。
• 实验操作过程非 常简单,仅仅是 将抗体,荧光标
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比为10:1;
荧光偏振免疫分析的优点
• 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂 的用量。
• 2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛 选检测。
• 3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期 保存,方法的重现性好。
• 4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,
荧光偏振免疫分析的缺点
• 1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般 来说FPIA的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。
荧光偏振免疫分析
---by沈未
LOGO
– 荧光偏振(fluorescence polarization, FP)通常定义为: 用垂直方向(丄)的偏振光激发荧光分子,然后测量发射 偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的荧光光强度(丨)
– 早期的荧光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于临床 化学和药物筛选;而A多生物学检测,是因其便于进行数 据分析和解释某些相关的物理学参数。
推而广之，还通过核 酸等小分子研究蛋白 -蛋白复合物之间的 结合。
用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH≈6.6)稀 释组蛋白溶液;
组蛋白浓度是DNA的10~500倍;
DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 2.荧光偏振度测量:
用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏 振度测量模式;
在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自 动设置在半波长模式, 这样激发光在水平分 量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;
• FP值是一个 比值,一般以 mP表示 (1P=1000mP)。
• 分子固定不动, 即完全偏振 时,FP值是 P0=1000 mP, 是理论上的最 大值;
论文的结构和主要内容
• 如果待测样本中 竞争抗原含量很 少(低于检测限), 荧光标记抗原与 抗体结合,FP值 较高(一般在150300 mP)。
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓 度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲 且有弹性此构型对应着一定的偏振度值. 在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光 偏振度在0.11左右;
• 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非 特异性结合),背景荧光和光散射的影响。
• 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围 (窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。
• 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需
对本实验室研究的思考
• 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋 白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标 签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数, 动力学白分子可能呈现更紧密、更小 的构型, 导致复合体分子
荧光偏振研究的一般步骤
• 1.确定最佳的荧光标记物;
• 2.确定公式中的各种参数;
• 3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定 最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性 关系;
• 4.建立标准曲线;
• 而待测样本中竞 争抗原的浓度增 加时,荧光标记抗
• FPIA是均相的 竞争免疫分析方 法,反应完全在 溶液系统中,不 需要分离结合的 和未结合的抗体。
• 实验操作过程非 常简单,仅仅是 将抗体,荧光标
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比为10:1;
荧光偏振免疫分析的优点
• 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂 的用量。
• 2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛 选检测。
• 3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期 保存,方法的重现性好。
• 4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,
荧光偏振免疫分析的缺点
• 1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般 来说FPIA的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。
荧光偏振免疫分析
---by沈未
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– 荧光偏振(fluorescence polarization, FP)通常定义为: 用垂直方向(丄)的偏振光激发荧光分子,然后测量发射 偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的荧光光强度(丨)
– 早期的荧光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于临床 化学和药物筛选;而A多生物学检测,是因其便于进行数 据分析和解释某些相关的物理学参数。
推而广之，还通过核 酸等小分子研究蛋白 -蛋白复合物之间的 结合。
用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH≈6.6)稀 释组蛋白溶液;
组蛋白浓度是DNA的10~500倍;
DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 2.荧光偏振度测量:
用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏 振度测量模式;
在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自 动设置在半波长模式, 这样激发光在水平分 量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;
• FP值是一个 比值,一般以 mP表示 (1P=1000mP)。
• 分子固定不动, 即完全偏振 时,FP值是 P0=1000 mP, 是理论上的最 大值;
论文的结构和主要内容
• 如果待测样本中 竞争抗原含量很 少(低于检测限), 荧光标记抗原与 抗体结合,FP值 较高(一般在150300 mP)。