驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定

大 肠杆 菌 TG1 、 噬 菌 粒 pHEN1
和辅助噬菌体 KM13 由 中国科学院 上 海生命科学研究 院马维骏博士惠赠 1． 1． 4 引物 。 文库构建及鉴定所用 的 引 物 见 表 1 。 其
32
中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 31 No． 4 2011
文库构建及鉴定所用的引物
Primers used for library construction and characterization
寡核苷酸序列 5'CTTGGTGGTCCTGGCTGC3' 酶切位点 Sfi I Not I
5'tcgc ggcccagccggccatggccCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG3' 5'cgagt gcggccgcGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG3' 5'cgagt gcggccgcTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG3' 5'GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC3' 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3' 5'GCCCCATTCAGATCCTCTTC3'
1122 1220 收稿日期: 2010修回日期: 2010* 食品科学与技术国 家 重 点 实验 室 目 标导 向 资 助项目 ( SKLFMB201002 ) 、 国家中 小 企 业 创新 基金 ( 09C26213604449 ) 、 江西省教育 厅青年科学基金( GJJ09442 ) 资助项目 ＊ ＊通讯作者， 电子信箱: xuyang1951@ yahoo． com． cn
AlpVhLD 位于抗体编码区的前导序列保守区， CH2 中， AlpVhLD 与 CH2 R可 R 位于 CH2 结构域高度保守区， 扩增获得普 通 抗体 编 码 基因、 长 铰 链 重 链 抗体 编 码 基 因和 短 铰 链 重 链 抗 体 编 码 基 因， 理论长度分别为 950bp 、 740bp 和 635bp 。 AlpVhSfiI 位 于 可 变 区 的 框架
中图分类号 Q789
在骆驼、 鲨鱼等动物中 存 在 天 然 缺失轻 链 的 抗体， chain antibodies， HCAbs ) ［1］。 虽 称为 重 链 抗 体 ( heavy然重链抗体的抗原抗体结合区域仅由 3 个互 补 决 定 区 ( complementarity determining regions， CDRs ) 构 成， 但是 仍然具有与普通抗体 相 当 的 抗原 结 合能 力。 仅 由 重 链 抗体的可 变 区 组 成的 抗体 称 为 单域 重 链 抗体 或 VHH chain 抗 体 ( variable domain of heavy chain of heavyantibody，VHH) ， Nbs ) 。 单域 重 链 纳米抗体( nanobody， 抗体分子 量 小， 大 约 含 130 个 氨 基 酸 残 基， 具有易表 达、 高水溶性、 耐 高 温、 耐 极 度 pH 值 等 独 特 性 质， 这为 工程化抗体提供了一个良好的来源
［4 ］
。
本研究采 用 非 免 疫 健康 羊 驼 ( Lama pacos ) 的 免 疫 细胞作为起始实验 材料， 通 过 巢 式 PCR 法 克 隆 全 套 单 域重链抗体基因， 构建 了 天 然 单域 重 链 抗体 噬 菌 体 展 示文库， 并对 一 种 小分子 真 菌毒 素 制 备 的 人工 抗原 进 行了淘选， 实验 结 果显示， 文 库的 多 样 性 良 好， 为淘选 获得针对特定抗原的单域 重 链 抗体 奠 定 了 技术 和 物 质 基础。
［5 ］
采 集的羊驼外周血与等体积磷酸缓冲液 PBS ( pH 7． 4 ) 800 g， 混合， 淋巴细胞分离液 ( 1． 077 ) 离 心 分 离 ( 20℃ ， 15 min ) ， 收集淋巴细胞。参照 RNAiso 试剂说明书提取 总 RNA， 紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分析总 RNA 的完整性， 以 oligo dT 反 转 录 获得 cDNA， 反 应条 30 min ， 50℃ ， 60 min ， 72℃ ， 15 min 。 件为 42℃ ， 1． 2． 2 VHH 基 因 的 扩 增 及 其 与 载 体 的 连 接 PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶， 经 巢 式 PCR 获得 重 链 抗体 的 可 变 区 编 码 基 因。 第 一 轮 PCR 分 别 以 引 物 AlpVhLD 和 CH2 R 扩 增 cDNA， 98℃ ， 反 应 条 件 为， 10s， 50℃ ， 20 s， 72℃ ， 1 min ， 20 个 循 环， 98℃ ， 10 s， 68℃ ， 1 min ， 72℃ 延伸 10 min 。 将 125 μl 第一轮 PCR 产 物 用 1． 2% 的 琼 脂 糖 凝胶 电泳， 回收 600bp ～ 750bp 的 DNA 片段， 适 当稀释 后 作 SfiI 和 为 第 二 轮 PCR 的 模 板， 分 别 用 引 物 AlpVhAlpVHHR1NotI， AlpVhSfiI 和 AlpVHHR2NotI， 进行扩 98℃ ， 10 s， 50℃ ， 20 s， 72℃ ， 40 s， 5个 增， 反应条件 为， 98℃ ， 10 s， 68℃ ， 40 s， 30 个 循 环， 72℃ 延 伸 10 循环， min 。经 DNA 片段回 收 试 剂 盒 回 收、 定 量， 于 － 20℃ 保 存备用。将噬菌粒 pHEN1 和 PCR 扩增 产 物 分 别 用 Sfi I、 Not I 双酶切， 经 琼 脂 糖 凝胶 回 收、 定 量 后， 以不同的 摩尔比， 在 16℃ ， 过夜连接。 1． 2． 3 1． 2． 4 噬菌 体 扩 增、 纯化和滴度测定 噬菌体文库 的构建 噬菌体的扩 5］ 增、 纯化以及滴度测定依据参考文献［ 进行。 选 择 最 佳 的 连 接 摩 尔 比，
2 南昌大学中德联合研究院
摘要
从未经主动免疫的健康羊驼( Lama pacos) 外周血淋巴细胞中提取总 RNA， 反转录后作为第
一轮 PCR 的模板。根据重链抗体保守区域设计引物， 经巢式 PCR 法扩增获得了全套重链抗体可
7 变区基因， 将其克隆至噬菌粒 pHEN1 ， 电转化大肠杆菌 TG1 得到初级抗体库 NAL， 含有 2 × 10 个
1． 2 1． 2． 1
方
法 淋巴细胞的分离、 总 RNA 的提取及反转录 将
以总量 1 μg 载体与 PCR 产物进行连接。连接产物经乙 醇沉淀后， 溶于 10 μl 无 菌 水， 分 10 次 进 行 电 穿孔 转 化 大肠杆菌 TG1 ， 感受 态 细胞 的 制 备 与 转 化， 按 照参考 文 5］ 献［ 进行。取 10 μl 电击、 培养 后 的 菌 液 倍 比 稀释， 涂 布氨苄青霉 素 2 × YT 培养 板， 计 算 库 容。 其 余 部分 全 部涂布于 24 cm × 24 cm 氨 苄 青 霉 素 2 × YT 培养 板， 37℃ ， 2 × YT 培养 基 将 培养 板 倒置培养 16h 。用 10ml， 上的菌苔刮洗 后， 加 入 终浓度 25% 甘 油， 分 装，－ 80℃ 采用 保存备用。 根据计算的库容量 结 果， 接 种 10 倍 库 容量 的 活细 100 μg / ml 氨苄青霉 胞 于 5ml 的 2 × YT( 含 2% 葡萄糖， 30℃ ， 220 r / min 振 摇 培养 至 OD600 达 0． 5 ， 素) ， 按 感染 37℃ ， 220r / min 振摇培养 60 复数 20∶ 1 加入辅助噬菌体， min 。将培养物离心， 用 50ml 的 2 × YT ( 含100 μg / ml 氨 30℃ ， 苄 青 霉 素 和 50 μg / ml 卡 那 霉 素 ) 重 悬 沉 淀， 220 r / min 振摇培养 过 夜 后， 3000g 离 心 取 上 清， 按标准 方法纯化 噬 菌 体 1． 2． 5
表1 Table 1
引物名称 AlpVhLD AlpVhSfiI AlpVHHR1NotI AlpVHHR2NotI CH2 R M13R pHENR
FR1 ) 并 在 其 5' 端 引 入 了 Sfi I 区 1 ( framework region 1 ， AlpVHHR1NotI 和 AlpVHHR2酶 切 位点 及 保 护 碱 基， NotI 分别位 于两 种 重 链 抗体 的 铰 链 区 ( hinge region ) ， R和 在 5' 端 引 入 了 Not I 酶 切 位点 及 保 护 碱 基。 M13pHEN1R 两条引物为噬菌粒 pHEN1 的通用引物。
中国生物工程杂志
China Biotechnology， 2011 ， 31 ( 4 ) : 3136
驼 源 天然单域 重 链 抗 体 库 的构建 与 鉴 定
涂 追
1， 2
*ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
许 杨
1， 2＊ ＊
刘 夏
1， 2
何庆华
1， 2
陶 勇
2 南昌 330047 )
( 1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室
南昌 330047
独立克隆， 菌落 PCR 和 Hinf I 酶切分析结果显 示， 克 隆 效 率 大 于 97% ， 文库 的 多 样 性 良 好。 辅 助
13 PDL， 得到噬菌体 展 示 文库命 名 为 NA滴 度 达 10 CFU / ml。 以 真 菌 毒 素 人 工 抗 原 噬菌体 救援 后，
DONMBSA 为目标抗原， PDL 进行了淘选， 对 NA第二轮洗脱物 中， 阳 性克 隆 率 达 36． 4% ， 提示针 PDL 多 样 性 较 好， 对目标抗原的噬菌体颗粒得到了有效富集， 文库 NA为 后 续淘 选 针 对 特定 抗 原 的单域重链抗体奠定了基础。 关键词 羊驼 纳米抗体 单域重链抗体 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 噬菌体文库
， 即 得到 噬 菌 体 抗 体 文 库， 取 10 μl 随机挑取 48 个克隆进行分析， 利
测定滴度， 其余分装于 － 80℃ 保存备用。 文库的鉴定 R 和 pHENR ) 进 行 PCR 验 用载体上的通用引物( M13PCR 产 物 用 Hinf I 进 行 酶 切 分 析， 证， 挑取 8 个 Hinf I 酶切图谱相似的克隆送生物技术服务公司测序。 1． 2． 6 噬菌体文库初步淘选 用 PBS 稀 释 DONMBSA 至适当浓度， 4℃ 包被过夜， 每孔加入 100 μl， 吸出 PBS 洗 板 3 次， 3% BSAPBS 在 37℃ 封闭 2 h ， 包被液， PBS 洗板 3 次， PBS 孵育过的噬菌体抗 加入与 3% BSA11 CFU ) ， 体库 100 μl ( 约 含 2 × 10 colony forming unit，
［2 ］
1
1． 1
材料与方法
材 料 试剂 淋巴细胞分 离 液 ( 1． 077 ) 购 自 上 海生工
1． 1． 1
PCR 试 剂 盒、 公 司，RNA 提 取 试 剂 RNAiso、RTPrimeSTAR 高保真 DNA 聚 合 酶、 限制性内切酶以及各 T4 连 接 酶 购 自 New 种 DNA 试 剂 盒 购 自 TaKaRa 公司， England Biolab 公司， 酵母 膏 和 蛋白 胨购 自 英 国 OXOID 公司， 其它化 学 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯。 DON 人工 抗原 ( DONMBSA) 依 据 参考 文献［ 3］制 备， 是 脱 氧 雪 腐镰 DON ) 与 甲 基 化 修饰 牛 血 清 刀菌烯 醇 ( Deoxynivalenol， 白 蛋 白 ( MBSA ) M13 的 共 价 偶 联 物。 HRP / AntiMonoclonal Conjugate 购自 GE Healthcare 公司( 代码 27942101 ) ， 四甲 基 联 苯 胺、 牛 血 清 白蛋白 ( bovine serum albumin ， BSA) 、 脱脂乳购自上海生物工程有限公司。 1． 1． 2 淋巴 细胞 采 用 真 空 采 血管 收 集 两 只健康 羊 驼外周血， 各 15ml， 用淋巴细胞分离 液 密 度 梯 度 离 心 收 集单核细胞。 1． 1． 3 菌株及噬菌粒