支原体PCR检测步骤
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支原体PCR检测步骤
一、提取支原体DNA
1，取1ml 细胞培养液，（对照为1ml新鲜培养液）13000g离心5min，用1ml D-PBSA（即无钙离子、镁离子的PBS）重悬，离心再重悬，重复两次。
2，沉淀加0. 2ml D-PBSA重悬，90℃，15min。
3，抽提DNA：氯仿，异丙醇抽提法
二、pcr体系：
灭菌水： 6 ul
F primer：0.5ul
R primer：0.5ul
cDNA 1 ul
d NTP MIX：0.8ul
buffer: 1 ul
放在PCR仪中：进行下列步骤：95℃7min 、72℃3min、65℃2min、72℃5min 打开热盖，美管中加入0.2ul taq酶
继续下面步骤：（95℃4s、65℃8s、72℃16s）每次外延1s 32个循环，
最后延伸72℃10min
附支原体16s 引物：（已blast过）
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
产物大小：705bp