细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
支原体污染检测试剂盒(PCR法)
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
（3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s；
（4）．进行PCR扩增
PCR扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
2.PCR反应
第一步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：
（1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
（2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
பைடு நூலகம்72°C，10 min，
3.反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
4.根据感染支原体类型的不同，扩增产物大小有所不同，第一步PCR产物在350～700bp 之间，第二步PCR产物在150～250bp之间。
支原体污染的检测方法
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
支原体试检测剂盒使用说明书(中文版)
支原体检测试剂盒使用说明书1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。
2.实验方法:巢式PCR的方法检测支原体污染：A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内B.95o C孵育5分钟C.短暂高速离心15秒钟左右D.试剂盒里的组份：引物混合物(Primer Mix) 20 µL阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。
(1)第一轮PCR:PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
E.热循环程序：将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。
PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
F. 热循环程序：将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。
试验结果：2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。
电泳结果见下图：图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。
阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。
细胞培养中支原体污染的检测方法
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法有哪些
支原体是一类细菌，常引起呼吸道感染、性传播疾病和眼部感染等，支原体感染的确诊通常需要进行相应的检测。
常用的支原体检测方法包括：
1. 核酸扩增技术：常见的包括PCR（聚合酶链反应）和实时荧光PCR。
通过使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测支原体的特定基因片段。
2. 培养法：将患者样本进行细菌培养，然后观察和鉴定培养出的菌落。
这种方法通常需要较长的培养时间，并且对支原体种类有一定的限制。
3. 免疫学方法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等，通过检测患者血清中的特异性抗体来判断是否感染了支原体。
4. 细胞培养法：将患者样本中的细胞培养，然后观察和鉴定培养出的细胞是否被支原体感染。
这种方法通常需要较长的培养时间，并且对细胞的感染敏感性较高。
5. 蛋白质检测法：通过检测患者样本中的特定支原体蛋白质的存在来判断是否感染了支原体。
需要注意的是，不同的检测方法有其各自的特点和应用范围，医生会根据具体情况选择合适的方法来进行支原体的检测。
支原体染色试剂盒
支原体染色检测试剂盒简介：支原体染色检测试剂盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一种经典的利用DNA 荧光染色法检测支原体污染的试剂盒，其原理是当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst 染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。
Hoechst Staining Kit 经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。
该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。
将盖玻片置于6孔板或其他培养皿内，接种细胞培养过夜，使融合率约为50%～80%。
2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst 固定液固定。
3、去除固定液，用PBS 或生理盐水洗2次，吸尽液体。
4、加入Hoechst 染色液孵育。
也宜用摇床，或手动晃动数次。
5、弃染色液，PBS 或生理盐水洗2次。
6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。
(二)悬浮细胞1、离心收集细胞样品于1.5ml 离心管内并弃液，加入Hoechst 固定液，缓缓悬起细胞，固定10min 或更长时间(亦可4℃过夜)。
2、低速离心去除固定液，用PBS 或生理盐水洗2次，每次3min 。
洗涤时手动晃动数次。
3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
编号 名称 DA0140 100T Storage 试剂(A): Hoechst 固定液 50ml RT 试剂(B): Hoechst 染色液 50ml -20℃ 避光 试剂(C): 荧光封片剂 5ml 4℃ 避光 使用说明书 1份4、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
支原体检测PCR方法
PCR法检测支原体实验原理：通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。
反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR 条件在进行检测。
实验目的：检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：0.5ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100ul，10ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；PCR引物：LZY-5Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACGLZY-5Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG产物大小：500bpLZY-6mycotest F：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCTLZY-6mycotest R：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC产物大小：250bp实验步骤：1、取样：直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为25ul体系）1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
25ul反应体系5#引物：LZY-5Myco universal反应体系反应条件检测培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul55℃30s10xBuffer 2.5ul72℃30sdNTP0.5ul25cycles或30cycles Easy Taq0.5ul72℃10min ddH2O19.5ul6#引物：LZY-6mycotest反应体系反应条件培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul51℃30s10xBuffer 2.5ul72℃20sdNTP0.5ul35cyclesEasy Taq0.5ul72℃5minddH2O19.5ul3.琼脂糖凝胶的制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
支原体检测说明书
SaveIt系列产品——支原体检测试剂盒说明书一、产品简介支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
针对细胞、培养基以及动物血清的支原体检测，我们推出了Myco-PCR-TEST快速支原体检测试剂盒。
本试剂盒基于PCR检测原理，根据支原体高度保守的16和23SrRNA区域设计的特异性引物，经过简单快速的PCR，从而迅速准确判断支原体污染是否被清除。
汉恒生物（）推出的SaveIt TM抗支原体试剂能够在不影响细胞状态的前提下能够有效的清除支原体污染，从而使一些珍贵的细胞受到支原体污染之后能够得到挽救。
二、产品包装产品规格见标签三、使用说明使用Trizol 法抽提待检测细胞的RNA，反转录为CDNA 后，加入支原体检测引物，进行PCR 检测细胞支原体污染情况。
四、操作步骤4.1样品处理1、A：培养贴壁细胞：不须胰酶消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml 比例加入。
B：悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2、细胞加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
3、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
4、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、4℃ 12,000g离心15min。
6、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min 。
支原体检测方法
支原体检测方法
一、抗体检测
1、采用抽血取样
2、检测肺炎支原体IgM、IgG抗体。
由于肺炎支原体IgM 抗体在感染后一周出现，因而此阶段就诊患者可以选择抗体检测。
3、IgM现症感染,IgG是既往感染。
二、抗原检测
1、采用咽拭子取样，即“捅嗓子”
2、PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。
但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。
弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测，或用培养法检测。
三、扫描电子显微镜法
1、扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。
四、培养法
1、为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。
常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
三种快速支原体检测试剂盒检测原理与优缺点比较
三种快速支原体检测试剂盒检测原理与优缺点比较在细胞培养，特别是传代细胞培养中，支原体污染率达到15-35%。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
传统的支原体检测方法很耗费时间，通常需要一天至数周，而且操作比较繁琐，准确度不高。
中国药典给定的支原体标准检测方法有两种：培养法和DNA染色法。
培养法方法简单，假阳性率低，但样品需要量高，耗时20天左右，时间漫长。
DNA染色法结果直观，假阳性率低，但需要荧光显微设备，实验操作复杂。
能否找到一种省时、省力且准确性高的方法检测支原体污染呢？目前，市场上具有多款支原体快速检测试剂盒，我们选取了其中3种品牌的快速支原体检测试剂盒，就其检测原理与优缺点进行一下比较。
一、美国CLARK Bioscience品牌一步法检测试剂盒美国CLARK Bioscience公司研发的一步法支原体检测试剂盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit，利用等温扩增的方法，可检测7种常见支原体的基因。
该检测方法与PCR方法类似，检测过程中，只需取少量细胞培养上清，及一个能控制温度的水浴锅或恒温金属浴，其扩增产物的颜色可通过肉眼直接观察判断，整个过程需要1小时左右。
该方法对仪器的要求比较低，理论上灵敏度比较高。
缺点在于检测的支原体种类太少，目前已发现的近200种支原体，只能检测其中的7种，检测范围太窄，也不符合国家药典的规定。
而且肉眼观察结果比较主观，有可能不同的实验人员判读的结果不一致。
二、美国Lonza品牌生物发光法检测试剂盒美国Lonza品牌的MycoAlertTM 和升级的MycoAlertTM PLUS支原体检测试剂盒，采用生物发光的方法，检测支原体酶活性。
其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中，而不存在于真核细胞中。
支原体污染细胞培养的检测方法
支原体污染细胞培养的检测方法
由于支原体种类不同，应采取不同的方法进行检测，常用的方法有如
下几种。
1、观察细胞的形态和生长特征
支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并
出现细胞病变，其病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
2、分离培养法
大多数支原体可出现特有的典型菌落。
该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
3、DNA结合荧光素染色法
此法简便、价廉，但若细胞片制备不当则结果难以判断。
4、电子显微镜和免疫电子显微镜法
此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
5、间接免疫荧光法和免疫印迹
简便、快速、特异性强，如果应用单克隆抗体试剂，效果会更好。
6、PCR技术
快速、敏感性高，但若条件控制不当容易出现假阴性和假阳性。
7、其他方法
放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等。
细胞支原体检测方法
细胞支原体检测方法
细胞支原体是一种细胞内寄生的细菌，可以引起多种疾病，包括肺炎和生殖道感染。
检测细胞支原体的方法通常包括以下几种：
1. PCR检测，聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的检测细胞支原体的方法。
该方法通过扩增细胞支原体的DNA片段，然后使用特定的引物和探针来检测扩增产物，从而确定是否存在细胞支原体感染。
2. 细胞培养，细胞培养是一种传统的检测方法，可以将患者样本中的细胞支原体培养出来，然后通过形态学、生化学和免疫学方法进行鉴定。
然而，这种方法需要较长的培养时间，通常需要几天甚至几周才能得出结果。
3. 免疫学检测，免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光染色法等，可以通过检测患者血清中的抗体水平来确定是否存在细胞支原体感染。
4. 基因测序，基因测序技术可以对细胞支原体的基因组进行全面的分析，从而确定其种属和亚型，为疾病流行病学调查和病原体
演化研究提供重要信息。
总的来说，细胞支原体的检测方法多种多样，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
在临床实践中，通常会结合多种方法进行综合检测，以提高检测的准确性和可靠性。
希望以上信息能够对你有所帮助。
细胞培养中支原体污染检测
支原体检验
1 液体培养基培养
取Rb/E3-15 5mL 接种于小瓶液体培养基中，再从小瓶中取0.2mL 移植于1小管液体培养基中，将小瓶与小管放37℃培养，分别于接种后5、10、15 日从培养瓶中取0.2mL 移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红；若无变化，在最后一次移植小管后观察14 日。
在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在pH 值变化达±0.5 时，应移植接种于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH 变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。
2 琼脂固体平板培养
在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2mL，接种于琼脂平板，置含5-10% CO2潮湿的环境37℃培养。
此外，在液体培养基颜色出现变化，在pH值变化达±0.5 时，也同时接种琼脂平板。
每5-7 日，在低倍显微镜下检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14 日观察，仍无菌落者停止观察。
细胞培养支原体检测方法
细胞培养支原体检测方法
细胞培养支原体检测方法是一种常用的病原体检测手段，适用于呼吸道感染等多种疾病的诊断。
支原体是一种细菌样微生物，常常引起上呼吸道或下呼吸道感染，严重的病例还可能引起心脏、肝、肺等多个器官的并发症。
因此，早期的支原体检测十分关键。
细胞培养支原体检测方法的基本原理是，在专门的培养基上，将样本中含有的支原体分离出来，并在细胞培养的条件下进行培养。
支原体培养成功后，可以进行进一步的鉴定和性状分析，以确认是否是病原体，从而确诊疾病。
具体操作步骤如下：
1. 采集样本：一般采用鼻咽分泌物、痰液、气道吸入物等样本。
采样前需要嘱患者停止使用抗生素等药物。
2. 均匀涂布样本：将样本均匀涂布在培养皿内的培养基上。
3. 培养：将培养皿置于恒温箱内，以满足支原体生长所需的条件。
培养周期一般需7~14天。
4. 观察：在培养周期内观察培养皿内是否出现生长典型的支原体菌落或支原体细胞，根据支原体繁殖的丰度和形态特点，进行初步判断。
此外，检测结果也可以通过核酸检测、荧光抗体法、酶联免疫吸附法等方法进行确认。
细胞培养支原体检测方法的优点是，能够在体外成功培养出支原体，从而进行进一步的鉴定和药敏试验，有助于找到最合适的治疗方案，并控制疾病传播。
但这种方法的缺点也很明显，例如需要较长的培养时间，操作难度较高，并且只能够检测到培养条件适宜的支原体菌种。
总之，对于呼吸道感染等疾病的治疗，及时发现和确诊病原体是十分重要的，其中细胞培养支原体检测方法是一种可靠的检测手段之
一，不仅可以促进疾病的早期诊断和治疗，而且还有助于控制疾病的传播。
C0296 支原体检测试剂盒说明书
包装清单：
产品编号 C0296-1 C0296-2 C0296-3
—ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
产品名称 固定液 Hoechst染色液 抗荧光淬灭封片液 说明书
包装 100ml 10ml 10ml
1份
保存条件：
4℃保存，一年有效，其中Hoechst染色液需避光保存。
注意事项：
使用说明：
1． 细胞样品的准备： a. 对于贴壁细胞，在六孔板或其它多孔板内或盖玻片上培养细胞至50%-80%满。 细胞培养过满会导致很难判断是否存在支原体污染。 b. 对于悬浮细胞，离心沉淀细胞，取少量细胞做细胞涂片，空气中充分晾干。
2． 用PBS按照1:10稀释Hoechst染色液(1体积Hoechst染色液加入9体积PBS)。
¾ 本试剂盒的检测效果图参考上图。左图为无支原体污染情况，中图为支原体轻度污染情况，箭头所指为微粒状的一些支 原体，右图为支原体重度污染情况，可见大量微粒状的支原体。
¾ 如果发现有支原体污染，建议更换无污染的细胞进行培养。如果有必要去除支原体，可以使用Mycoplasma Removal Agent、cyprofloxacin或BM-Cyclin去除支原体污染。
稀释后的Hoechst染色液宜在24小时内使用。 3． 加适量固定液固定10-20分钟。
对于六孔板的一个孔，加入1ml固定液。确保固定液充分覆盖样品，固定前切勿对细胞进行洗涤。另外对于贴壁细胞，固 定前需去除培养液。 4． 去除固定液，空气中晾干。 5． 加适量10倍稀释的Hoechst染色液室温染色10-30分钟。 对于六孔板的一个孔，加入1ml染色液。确保染色液充分覆盖样品，染色时注意避光。可以用铝箔纸避光。 6． 去除染色液，空气中晾干。 7． 滴加试剂盒中提供的抗荧光淬灭封片液，封片后荧光显微镜下观察蓝色荧光。 荧光显微镜观察时需400倍或1000倍放大观察(需使用油镜)。参考上图判断支原体污染情况。没有支原体污染或其它原核 生物污染的细胞样品，仅观察到细胞核的蓝色荧光，线粒体DNA不会被染色。有支原体污染的细胞样品可以观察到细胞 核周围微粒状或丝状蓝色荧光。支原体污染严重的细胞可以观察到大量微粒状或丝状蓝色荧光。有细菌、酵母或霉菌污 染的情况虽然Hoechst染色也会呈阳性，但细菌、酵母或霉菌污染在光学显微镜下可以观察到，而支原体观察不到，由此 可以初步区分是支原体还是其它微生物。如有必要进一步鉴定，可以通过把支原体接种培养和RT-PCR等方法进行进一步 检测。
各种细胞用快速支原体检测试剂盒和方法优缺点比较
各种细胞用快速支原体检测试剂盒和方法优缺点比较
（2016年10月16日）
具体选购步骤：
首先，您应该根据自己实验室的仪器情况，进行选择。
如果您实验室拥有发光检测仪（Luminometer）或者具有发光检测功能的多功能酶标仪以及-80 ℃低温冰箱，我们强烈建议您选购《发光法支原体检测试剂盒》。
《发光法支原体检测试剂盒》具有检测时间短、支原体检出率高、不会产生假阳性和假阴性、可以区分死活支原体等优点。
如果您的实验室没有上述条件，您只能选择《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《PCR法支原体检测试剂盒》。
其次，您可以根据检测时间长短、产品价格、支原体识别率、假阳性和假阴性概率、样品是否需要前处理等进行
综合选择。
最后，作为支原体检测领域的共识：单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。
严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。
如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选上海易色《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR 法支原体检测试剂盒》和《发光法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果，检测的正确率应该在99.9%以上。
如果同时使用这三种试剂盒进行检测，检测的正确率应该在99.99%以上。
检验项目支原体检测方法汇总
检验项目支原体检测方法汇总如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测？支原体的检测方法有哪些？目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。
各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。
一、培养法培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。
常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
（一）材料与设备1. 精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
2. 支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
3. 其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。
（二）操作步骤1. 样品的储存。
样品取材后，最好尽快进行检测。
样品如在24h 以内进行支原体检测，可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。
-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃），每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。
记录实验结果。
（三）结果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀二、荧光指示细胞法荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。
常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。
该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。
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细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
（2016年10月16日）
哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：
一、培养法
●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转
接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体
培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可
的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支
原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最
常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无
法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞
支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中
收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法
●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培
养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，
如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料
染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污
染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细
胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的
能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；
（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
●《荧光染色法支原体检测试剂盒》主要厂家：读者可以根据《中国药典》
中收录的荧光染色法支原体检测方法进行操作。
三、PCR法
●原理：设计支原体特意的引物，进行PCR扩增。
●优点：（1）快速，往往只需几小时；（2）可检测的支原体种类较多；（3）
目前，该方法是细胞培养液中支原体污染检测的常规方法之一。
●缺点：（1）整个过程大约需要3个小时；（2）由于细胞培养数天后，培
养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品的前处理一般是
PCR法不可或缺的环节；（3）PCR产物的电泳，需要用到EB等潜在的致
癌物质；（4）需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器；
（5）存在假阳性和假阴性。
●《PCR法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）Sigma公司的LookOut
Mycoplasma PCR Detection Kit（货号：MP0035），价格：价格：3469
元/24次；（2）上海易色医疗科技有限公司的《PCR法支原体检测试剂盒》，
货号：PM008；价格：1000元/100次；（3）以色列Biological Industries
（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit，货号：20-700-10，
价格：约1000元/10次。
四、RD-RCA恒温扩增法
●原理：这个是上海易色医疗科技公司依托其RD-RCA恒温扩增技术开发的
支原体检测产品，产品名称：《一步法恒温支原体检测试剂盒》。
该产品
非常具有特色，详细原理可以访问其网站了解。
●优点：《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的RD-RCA恒温基因扩
增技术，彻底解决了上述PCR法的缺点：（1）整个检测过程只需1小时，
大大缩短了检测时间；（2）细胞培养液中的PCR抑制剂，不会抑制该产
品的恒温基因扩增，所以任何情况下都无需样品的前处理；（3）恒温基
因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍，检测只需使用1μL的细胞培养
液，无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提；（4）恒温基因扩
增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；
（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测
过程只需一个水浴锅。
●缺点：该产品只能保证认识最常见的污染细胞的13种支原体，虽然这
13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。
但是，不排除《一
步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率
极低的支原体。
●《RD-RCA恒温扩增法支原体检测试剂盒》主要厂家：据笔者了解，目前
只有上海易色医疗科技公司生产《一步法恒温支原体检测试剂盒》，货号：MD001，价格大约15-19元/次
五、酶活法
●原理：通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性。
●优点：（1）支原体识别率高，100多种支原体，只有1种不能识别，而
不能识别的这种支原体几乎不会出现在体外培养的细胞中；（2）可以区
分支原体的死活；（3）不存在假阳性和假阴性；（4）检测时间短，整个
检测过程只需25分钟。
●缺点：需要用到具有发光检测功能的多功能酶标仪或独立的发光检测仪。
●《酶活法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）上海易色医疗科技有限公
司的《发光法支原体检测试剂盒》，货号：LM009；价格：1250元/50次。
（2）Lonza公司的 MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit，货号：
LT07-710；价格：大约10000元/100次。
总结：以上每种支原体检测方法各有优缺点，大家应该根据自己试验的需要和实验室条件进行选择。
此外，作为支原体检测领域的共识，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒和检测方法，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。
严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。