支原体污染的检测方法
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法有哪些
支原体检测方法主要有以下几种：
1. PCR法：即聚合酶链反应，在医学领域中被广泛应用于病原体的检测。
PCR法可以通过扩增病原体DNA的特定片段来检测支原体的存在与否。
该方法具有高灵敏度和高特异性。
2. 培养法：支原体可以在特定培养基中进行培养和繁殖。
通过将样品涂布到培养基上，培养一定时间后观察培养基上是否有支原体的生长，从而判断有无感染。
3. 免疫学检测法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法等。
这些方法通过检测患者血清中的特定抗体或抗原来判断是否感染支原体。
4. 基因测序法：通过对支原体基因组进行测序，可以准确确定其种类和亚型，进而进行分子流行病学研究和溯源分析。
5. 免疫组化方法：利用特定抗体对支原体进行染色，通过显微镜观察标记物的分布和形态特征来检测支原体的存在。
以上是常用的支原体检测方法，每种方法都有其适用的场景和优缺点。
儿童支原体检测方法
儿童支原体检测方法
儿童支原体的检测方法主要有以下几种：
1. 喉拭子检测法：通过用棉签或拭子在儿童的喉部刮取样本，然后将样本送往实验室进行检测。
这种方法可以检测儿童的支原体感染，尤其适用于儿童咽喉部有炎症症状的情况。
2. 尿液检测法：通过收集儿童清晨第一次小便的尿液样本，然后送往实验室进行检测。
这种方法可以检测儿童的尿液中是否存在支原体感染。
尿液检测法在幼儿中应用较广，操作简单，无创伤。
3. 血清学检测法：通过采集儿童的静脉血，然后检测血清中的特异性支原体抗体水平。
这种方法可以检测儿童是否曾经感染过支原体，并且可以区分活动感染和既往感染。
4. 分子生物学检测法：通过采集儿童的咽拭子样本，然后通过PCR等分子生物学技术检测支原体的核酸。
这种方法可以快速、准确地检测儿童是否感染了支原体，并且可以确定感染的支原体亚型。
需要注意的是，具体使用哪种方法进行儿童支原体的检测取决于临床情况和实际需要，医生会根据患儿的症状和体征来决定使用哪种方法进行检测。
PCR方法 支原体检测
PCR检测支原体方法如下：
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。
请注意：待检
细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。
2、将盛有100ul待检培养液的 1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热
5min。
请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。
（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）
3、高速离心，13200rpm，1min。
4、配制PCR反应体系：
1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
3）PCR反应体系：
H2O（灭菌超纯水）13 ul
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
dNTP0.8 ul
Primer(+) (10uM)0.5 ul
Primer(-)(10uM)0.5 ul
Polymerase0.2 ul
Sample 3 ul
4)PCR反应程序：
94℃2min
94℃30sec
55℃30sec
72℃20sec
GOTO step 2 , 36 times
72℃7min
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。
引物序列：
Primer(+)：’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’
Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’。
细胞培养中支原体污染的检测方法
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
一种快速判定细胞培养中支原体污染的方法——瓜氨酸测定法
．
技 术 方 法
一
种快速判定细胞培养 中支原体污染 的方法——瓜氨酸测定法
梁少东 ， 黄小 乐 ， 媛 ， 琴 ， 严 杨 肖成祖
广 州 铭 康 生物 工 程 有 限公 司 ， 东 广 州 ５ ０ ３ 广 １７ ０ 【 要 ］ 目 的 ： 发 一 种 简便 、 摘 开 快速 、 及 时发 现 细 胞 培 养 中支 原体 污 染 的方 法 。 法 ： Ｈ Ｌ 能 方 用 Ｐ Ｃ检 测 细 胞培 养 中瓜 氨 酸 是 否 存 在 及 其量 的大 小 。 结 果 ： 当细 胞 培 养 被 支 原 体 污 染 时 ， 养 基 中精 氨酸 量 明 显下 降 ， 培 同时 有瓜 氨酸 出现 ； 当支 原体 被 消 除 后 ， 氨 酸 即消 失 。 论 ： 细胞 培 养 中瓜 氨 酸 的 出现 与支 原 体 污 染 的关 系是 特 异 的 ， Ｈ Ｌ 在 ２ ｈ内 即可 检 出， 明该 方 瓜 结 在 用 ＰＣ 表 法可 靠 、 便 、 简 快速 ， 可作 为细 胞 培 养 过 程 中支原 体 污 染 的 常规 监测 手 段 。 【 键 词 ］ 细胞 培 养 ； 原 体 污 染 ； 氨 酸 ； 氨 酸 脱 亚 氨 酶 ； 效 液相 色谱 关 支 瓜 精 高
ｗａ ａ ａ ｒ ｇ ｌ ｒ ｉ ｓ ｃｉ ｎ ｆ ｒ ｍｙ ｐｌｓ ｏ ａ ｉａ ｉｎ． ｙ ｓ ｅ ｕ ａ ｎ ｐｅ ｔｏ ｏ ｃｏ ａ ｍａ ｃ ｎｔｍ ｎ ｔｏ
［ ｙｗｏｄ ］ ｃｌ ｃｌ ｒ； ｙｏ ｌ ｍ ｏ ｔ ｎｔ ｎ ｃ ｒｌｎ ；ａ ｉ ｎｄｉ ｉａｅ Ｈ Ｌ Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｕｔ ｅ ｍ ｃｐａ ａｃｎａ ａｉ ； ｉｕｌ ｅ ｒ ｎ ｅｅｍ ｎｓ； Ｐ Ｃ ｌ ｕ ｓ ｍｉ ｏ ｔ ｉ ｇｉ
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支原体检测PCR方法
PCR法检测支原体实验原理：通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。
反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR 条件在进行检测。
实验目的：检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：0.5ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100ul，10ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；PCR引物：LZY-5Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACGLZY-5Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG产物大小：500bpLZY-6mycotest F：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCTLZY-6mycotest R：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC产物大小：250bp实验步骤：1、取样：直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为25ul体系）1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
25ul反应体系5#引物：LZY-5Myco universal反应体系反应条件检测培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul55℃30s10xBuffer 2.5ul72℃30sdNTP0.5ul25cycles或30cycles Easy Taq0.5ul72℃10min ddH2O19.5ul6#引物：LZY-6mycotest反应体系反应条件培养基1ul94℃3minLZY-5-F0.5ul94℃30sLZY-5-R0.5ul51℃30s10xBuffer 2.5ul72℃20sdNTP0.5ul35cyclesEasy Taq0.5ul72℃5minddH2O19.5ul3.琼脂糖凝胶的制备1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
支原体检测方法
支原体检测方法
一、抗体检测
1、采用抽血取样
2、检测肺炎支原体IgM、IgG抗体。
由于肺炎支原体IgM 抗体在感染后一周出现，因而此阶段就诊患者可以选择抗体检测。
3、IgM现症感染,IgG是既往感染。
二、抗原检测
1、采用咽拭子取样，即“捅嗓子”
2、PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。
但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。
弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测，或用培养法检测。
三、扫描电子显微镜法
1、扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。
四、培养法
1、为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。
常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
支原体检测荧光法和PCR法灵敏度实验
支原体检测荧光法和PCR法灵敏度实验一、目的通过实验获得支原体检测荧光法和PCR法灵敏度数据，了解两种方法的灵敏度，以确定支原体检测采用的实验方法。
二、试验方法和材料1、方法：用已知支原体污染的样本作为阳性样本，通过系列稀释，检测稀释后的样本的的支原体检测结果，用荧光法和PCR法两种方法检测，比较两种方法的差异。
并且荧光法在第二次读数时，每2分钟读一次数，观察读数的变化。
2、实验材料和试剂：取支原体阴性细胞215和支原体阳性细胞216分别作为阴性和阳性实验样本。
荧光法支原体检测试剂盒使用LONZA MycoAlert Mycoplasma Detection Kit ，PCR支原体检测试剂盒使用HD MycoScan。
三、实验步骤1、把阴性样本215按30，120，480，1920倍稀释，把阳性样本216按30，60，120，240，480，960，1920，3840倍稀释。
2、按荧光法试剂盒操作步骤操作，把1系列稀释的样本进行检测，读取A值，并且在第一次A值读数后两分钟再读取A值一次。
3、按荧光法试剂盒操作步骤操作，读取B值，并且在第一次B值读数后每两分钟读取B值一次，一共读取10次。
4、计算B/A值的结果。
5、取1系列稀释的样本用PCR法检测。
四、实验结果根据荧光法和PCR法检测结果比较，荧光法通过延长反应时间，可以检出稀释240倍的阳性216样本的支原体，PCR法检测支原体的灵敏度在本次实验中也是样本240倍稀释这个范围。
所以通过改良后的荧光法和PCR法检测支原体的灵敏度是基本差不多的。
而荧光法检测所需时间大概是1小时，而PCR法检测时间需要8小时左右，因此荧光法是一个更适合实验室支原体检测的方法。
使用荧光法检测样本支原体在第一次读取B值后，在过20分钟读取一次B值，可以增加试剂的灵敏度，可最大化检测出支原体。
支原体污染及检测
支原体污染及检测
1）支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著
影响细胞功能干扰实验结果。
支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。
支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗
培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。
因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。
2）支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此
难以发现。
目前，支原体检测的方法有以下几种。
（a）相差显微镜观察；
（b）低张处理地衣红染色法；
（c）荧光染色法；
（d）酶标法；
（e）PCR法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。
优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小
Cellmax胎牛血清Max choice, Max cells
此外，使用高品质的血清培养细胞，可以降低细胞被支原体污染的可能性。
Cellmax胎牛血清Max choice, Max cells。
细胞培养中支原体污染检测
支原体检验
1 液体培养基培养
取Rb/E3-15 5mL 接种于小瓶液体培养基中，再从小瓶中取0.2mL 移植于1小管液体培养基中，将小瓶与小管放37℃培养，分别于接种后5、10、15 日从培养瓶中取0.2mL 移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红；若无变化，在最后一次移植小管后观察14 日。
在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在pH 值变化达±0.5 时，应移植接种于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH 变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。
2 琼脂固体平板培养
在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2mL，接种于琼脂平板，置含5-10% CO2潮湿的环境37℃培养。
此外，在液体培养基颜色出现变化，在pH值变化达±0.5 时，也同时接种琼脂平板。
每5-7 日，在低倍显微镜下检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14 日观察，仍无菌落者停止观察。
如何检测血清是否含有支原体污染 160617
如何检测血清是否含有支原体污染？血清有没有支原体污染这是细胞培养用户非常关心的问题。
其检测方法有相当的特殊性，现介绍如下：1.必须认识到血清不适合直接检测，在对其进行检测之前，必须将其中可能含有的支原体进行大量的繁殖。
这是因为：（1）商品化的血清都是经过0.1 μm的滤膜多次过滤的而且长期低温保存和运输，其中即使含有支原体，其含量也必然是极其微量的（比如1mL就含有几个支原体），直接检测一般是检测不出来的；（2）如果不对其进行大量繁殖而直接用《一步法恒温支原体检测试剂盒》进行检测，由于该试剂盒灵敏度非常高，很多血清的检测结果会介于阳性和阴性之间。
但是这也只能说明其含有微量的支原体DNA，不能说明其含有活的支原体。
当然，如果检测结果与阳性对照完全一样，呈典型的蓝绿色，说明其支原体DNA的含量确实较高，也间接说明其血清质量较差，在其生产过程中，没有控制好支原体的污染。
如果检测结果与阴性对照完全一样，呈典型的紫红色，也间接说明其血清质量较高。
但是以上几种结果都不能直接说明该血清一定含有活的支原体或者一定不含有活的支原体。
（3）血清往往含有抑制PCR扩增的成分，直接用PCR法进行检测也是无法准确判断的。
2.血清样品中支原体的繁殖方法：将1 mL的血清按1:10稀释到支原体液体培养基中【注意：（1）血清接种的量不能太小，一般接种不少于1 mL，否则可能漏检；（2）不能使用常规的哺乳动物细胞培养液代替支原体液体培养基。
因为经我们测试：在没有动物细胞共培养的情况下，支原体在含10%血清的动物细胞培养液如DMEM、1640、MEM、GMEM中繁殖非常缓慢，甚至完全不繁殖。
】，然后部分放4℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培养箱或者普通的细菌培养箱中培养3天【经我们测试3天的培养已经足够而且是最佳选择】。
3天后，进行支原体的检测。
3.培养3天后的样品中支原体的检测方法，可以在本公司《发光法支原体检测试剂盒》、《一步法恒温支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》中任选1-3种进行检测。
支原体检测荧光法和PCR法灵敏度实验
支原体检测荧光法和PCR法灵敏度实验一、目的通过实验获得支原体检测荧光法和PCR法灵敏度数据，了解两种方法的灵敏度，以确定支原体检测采用的实验方法。
二、试验方法和材料1、方法：用已知支原体污染的样本作为阳性样本，通过系列稀释，检测稀释后的样本的的支原体检测结果，用荧光法和PCR法两种方法检测，比较两种方法的差异。
并且荧光法在第二次读数时，每2分钟读一次数，观察读数的变化。
2、实验材料和试剂：取支原体阴性细胞215和支原体阳性细胞216分别作为阴性和阳性实验样本。
荧光法支原体检测试剂盒使用LONZA MycoAlert Mycoplasma Detection Kit ，PCR支原体检测试剂盒使用HD MycoScan。
三、实验步骤1、把阴性样本215按30，120，480，1920倍稀释，把阳性样本216按30，60，120，240，480，960，1920，3840倍稀释。
2、按荧光法试剂盒操作步骤操作，把1系列稀释的样本进行检测，读取A值，并且在第一次A值读数后两分钟再读取A值一次。
3、按荧光法试剂盒操作步骤操作，读取B值，并且在第一次B值读数后每两分钟读取B值一次，一共读取10次。
4、计算B/A值的结果。
5、取1系列稀释的样本用PCR法检测。
四、实验结果根据荧光法和PCR法检测结果比较，荧光法通过延长反应时间，可以检出稀释240倍的阳性216样本的支原体，PCR法检测支原体的灵敏度在本次实验中也是样本240倍稀释这个范围。
所以通过改良后的荧光法和PCR法检测支原体的灵敏度是基本差不多的。
而荧光法检测所需时间大概是1小时，而PCR法检测时间需要8小时左右，因此荧光法是一个更适合实验室支原体检测的方法。
使用荧光法检测样本支原体在第一次读取B值后，在过20分钟读取一次B值，可以增加试剂的灵敏度，可最大化检测出支原体。
支原体感染的检测方法和结果解读
支原体感染的检测方法和结果解读支原体感染是一种常见的细菌性感染，主要通过性传播、空气飞沫传播、母婴传播等途径传染给人体。
早期感染可能没有明显的症状，但长期感染可能导致多种疾病，例如尿道炎、阴道炎、肺炎等。
及早发现和治疗支原体感染对于预防疾病的发生至关重要。
本文将介绍支原体感染的检测方法和结果解读。
一、检测方法目前，常用的支原体感染检测方法包括以下几种：1. PCR扩增法PCR扩增法是一种敏感、特异的检测方法，可以通过扩增病原体的核酸片段来检测其存在。
该方法可以从各种临床样本中检测支原体感染，如尿液、生殖道分泌物、呼吸道分泌物等。
PCR扩增法的优势在于其高灵敏度和特异性，可以迅速、准确地确定支原体感染的存在。
2. 免疫学检测法免疫学检测法常用于检测体液中的抗原或抗体。
例如，ELISA法可以检测支原体感染产生的特定抗体，间接反映感染的存在。
免疫学检测法的优势在于其简单、方便，可以应用于大规模筛查。
3. 细菌培养法细菌培养法是一种传统的检测方法，通过将临床样本接种到培养基中，培养出支原体来进行检测。
尽管这种方法操作复杂且耗时较长，但对于药物敏感性和耐药性的检测具有重要意义。
二、结果解读支原体感染的检测结果需要经过专业人员进行解读，以下是一些常见的结果解读：1. 阳性结果阳性结果表示样本中检测到了支原体的存在。
阳性结果应该结合临床症状和其他检测结果来综合判断，确定是否存在感染。
对于疑似感染的患者，可以在确诊后及时进行治疗。
2. 阴性结果阴性结果表示样本中未检测到支原体的存在。
然而，阴性结果并不能完全排除感染的可能性。
如果存在明显的症状或高度怀疑感染，可以进行重复检测或尝试其他的检测方法来确认结果。
3. 疑似阳性结果疑似阳性结果表示样本中存在一定程度的支原体感染疑似。
此时，建议进行复检或进行其他相关检测以确诊。
需要注意的是，支原体感染的检测结果不仅仅依赖于检测方法的准确性，还受到样本采集、保存和运输等因素的影响。
支原体污染的实验室检测及鉴定方法
英聪“２，刘灿“３，宁宜宝”，王海光１ （１．中国兽医药品监察所，北京１ ０００８１；２．华中农业大学，湖北武汉４３００７０；３．中国农业大学，北京１ ００１９ ３；）
摘要：支原体污染造成的危害非常广泛，其影响涉组织培养的细胞、鸡胚及其生产的疫苗，应当引起高度重视。本文 对支原体污染的几种常见检测及鉴定方法进行综述，包括ＤＮＡ荧光染色法、ＰＣＲ、ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ等，以其为支原体污染的检测 研究提供参考。 关键词：支原体；污染；检测；鉴定
作者简介：英聪（１９８７年・），男，硕士生，从事兽医微生物与免疫学研究。Ｅ－ｍａｉｈ ｙｉｎｇｃｌ９８７＠１６３．ｔｏｍ ＋通讯作者：宁宜宝（１９５６年・），男．研究员，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｉｎｇｙｉｂａｏ＠ｉｖｄｃ．ｇｏｖ．ｃｎ
第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集（２０１２年） 能够对支原体污染进行定性观察。分离培养法多用于常规的支原体检测，同时比较ＰＣＲ法、ＤＮＡ荧光染色法， 进行最后的实验结果分析。 １．２酶联免疫吸附试验（ＥＬｆＳＡ） ＥＬＩＳＡ用于支原体污染的检测中，有着良好的特异性和敏感性，一次可 以完成大量样品的检测。例如，Ｊｏｃｏｂｓｕ刚用捕获ＥＬＩＳＡ，以肺炎支原体Ｐｌ抗原的膜蛋白（１７０ＫＤａ）的单克 隆抗体３小时可以检测出感染者呼吸道分泌物的Ｐｌ蛋白，特异性强，敏感性达１０４ＣＦＵ／ｍｌ。１９９５年高光等 ｕ¨就将制备的抗口腔支原体、精氨酸支原体单克隆抗体应用到检测支原体污染的ＥＬＩＳＡ中，可以有效的检 测出污染的口腔支原体、精氨酸支原体。如今已有Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ等公司开发了针对细胞中污染支原体的ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒，具有简便、快速、定量定性检测等特点。
２支原体污染的鉴定
２．１
支原体污染细胞培养的检测方法
支原体污染细胞培养的检测方法
由于支原体种类不同，应采取不同的方法进行检测，常用的方法有如
下几种。
1、观察细胞的形态和生长特征
支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并
出现细胞病变，其病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
2、分离培养法
大多数支原体可出现特有的典型菌落。
该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
3、DNA结合荧光素染色法
此法简便、价廉，但若细胞片制备不当则结果难以判断。
4、电子显微镜和免疫电子显微镜法
此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
5、间接免疫荧光法和免疫印迹
简便、快速、特异性强，如果应用单克隆抗体试剂，效果会更好。
6、PCR技术
快速、敏感性高，但若条件控制不当容易出现假阴性和假阳性。
7、其他方法
放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等。
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本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
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产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒
产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132estbio@ 传真：021-60853530
产品简介： 支原体是一种大小仅为 0.2~0.3 μm，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 μm）的
原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到 63%，因而细胞培养过程中被支原 体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的 DNA、 RNA 及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体 污染一般难以察觉，严重时会导致细胞生长缓慢，状态不好。
产品说明书
支原体检测试剂盒
产品组成：
产品编号 规格 固定液 染色液 洗涤液
使用说明书
BB-4314-1 20T 20ml 10ml 60ml 1
BB-4314-2 50T 50ml 25ml
150ml 1
储存条件： 2-8℃避光保存。
有效期： 一年。
注意事项： ● 请在使用前仔细阅读并参考该说明书。 ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常
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荧光显微镜观察： 染色后，置于荧光显微镜下，选用 340-350nm 的激发光观察，最大发射波长为 461nm。
结果分析 ： 染色后，置于荧光显微镜下，选用 340-350nm 的激发光观察： 正常细胞的细胞核呈弥散均匀蓝色荧光，核外无荧光点。若有支原体污染，在细胞核外
与细胞表面会出现蓝色萤光小点或丝状点。其形状一致，与细胞碎片染成之不规则点状物不 同。
检测方法： 荧光显微镜
样本类型： ● 悬浮细胞
● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS
● 纯水
● 移液器及吸头
● 离心机
●荧光显微镜
使用方法：
使用注意事项： ● 培养板、细胞爬片、甩片、滴片等均可检测。下面步骤以贴壁细胞在细胞培养板原位检测为例，
其他类型样品制作好后参考以下步骤即可。
样品染色： 1、 培养好的细胞吸出培养基，用不含酚红的 Hanks 液漂洗一次。 2、 加入适量固定液固定细胞 10 分钟。吸出固定液。 3、 加入适量固定液固定细胞 10 分钟。 4、 吸出固定液。自然晾干。 5、 加入适量染色液后轻轻混匀于室温避光条件下静置 20 分钟。 6、 吸出染色液。 7、 滴加洗涤液洗涤 2 次。晾干。
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品说明书
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