实验技术手册(细胞免疫方面)

单克隆抗体的制备

1975年，Köhler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。

1试验材料

1.1试验动物和细胞

雌性6～8周龄BALB/c小鼠

SP2/0骨髓瘤细胞

1.2主要实验试剂

HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司；

DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司；

牛血清白蛋白（BSA）

1.3主要实验仪器和耗材

CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ）

酶联检测仪（BIO-RAD Model 680）

血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）

pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器）

APL高压灭菌锅（CL-32L）

生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司)

三恒电泳仪（JY600C）

数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司）

电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器）

分光光度计（WPA Biowav eⅡ+）

进口液氮罐（Thermo）

Protein A柱

恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂）

微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市）

电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械）

低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司)

高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK）

倒置显微镜（Nikon TS100）

超低温冰箱(Thermo)

96孔酶标板（）

96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL)

2主要试剂配制

2.1常规试剂配制

PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）：

A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；

B液（0.2 mol/L NaH2PO4）：NaH2PO4·2H2O 3.12g,加蒸馏水至1000ml；

取A液81ml加B液19ml混合，再用生理盐水（或蒸馏水）做10倍稀释即成。

饱和硫酸铵溶液（pH7.4）：称取80~85g A·R级(NH4)2SO4，以50~80℃蒸馏水100ml溶解，搅拌20min，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调pH至7.4。配好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。取饱和硫酸铵40ml，加蒸馏水60ml稀释即成40%饱和硫酸铵。

2.2细胞融合试剂配制

DMEM不完全培养基：DMEM粉1袋，3.7g NaHCO3，用1mol/L HCl调pH至7.2-7.3，加灭菌超纯水定容至1000ml。0.22μm滤膜过滤除菌至1L试剂瓶中，4℃保存。

胎牛血清（FBS）的灭活：56℃，灭活30min，分装100ml或50ml一瓶，-20℃冻存。

10%FBS完全培养基：FBS 10ml，DMEM不完全培养基90ml，三抗溶液1ml，4℃保存。

20%FBS完全培养基：FBS 20ml，DMEM不完全培养基80ml，三抗溶液1ml，4℃保存。

HAT培养基：20%FBS培养基98ml，HAT（50×）贮存液2ml。

HT培养基：20%FBS培养基98ml，HT（50×）贮存液2ml。

冻存液：完全培养基:DMSO=9.2:0.8，即含8%DMSO，与培养过程中使用的血清保持一致，需新鲜配制。

2.3ELISA试剂配制

(1) PBS 10×stock solution

40g Na2HPO4·12H2O

5g KH2PO4

81g NaCl

1.0mL 20% NaN3 (20g NaN3溶解在100mL蒸馏水中)

用蒸馏水溶解，定容到1L。

(2) Coating buffer

1.59g Na2CO3

2.93g NaHCO3

1.0mL 20% NaN3

用800mL蒸馏水溶解，调pH到9.6，定容到1L。

(3) Blocking buffer

将0.5gBSA 溶解在100mL Coating buffer 中（即0.5%BSA溶液）。

(4) Tween buffer

100mL PBS 10×stock solution

5g BSA

0.5mL Tween 20

1.0mL 20% NaN3

用800mL蒸馏水溶解，定容到1L。

(5) Tween wash buffer

45g NaCl

2.5mL Tween 20

用足量蒸馏水溶解，定容到5L。

(6) Enzyme substrate buffer

97mL Diethanolamine（乙二醇胺）

700mL 蒸馏水

1.0mL 20% NaN3

用大约100mL 1M浓盐酸调pH到9.8，然后加101mg MgCl2·H2O（相当于181.4mg

MgCl2·12H2O），最后定容到1L。

(7) Substrate（现用现配）

将1个NPP药片溶解在5mL Enzyme substrate buffer中，黑暗条件下保存。

（8）OPD底物缓冲液：

0.2M Na2HPO4 25.7ml

0.1M 柠檬酸 24.3ml

加蒸馏水 50ml，pH 5.0

（9）OPD底物（现配先用）

OPD工作液配制：10ml底物缓冲液中加入5mg OPD，完全混匀后加H2O2(浓度

30%)4µl/10ml即可，100µl/孔，492 nm的波长读数。

2.4SDS-PAGE试剂配制

30%聚丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，充分溶解后过滤，调pH7.0，4℃棕色瓶保存备用。

分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：18.17g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至8.8，加蒸馏水定容至100ml。

浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：12.11g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至6.8，加蒸馏水定容至100ml。

10%（w/v）SDS溶液：10g SDS，加蒸馏水定容至100ml。

10%（w/v）过硫酸铵：1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解，300μl/支分装-20℃冻存。

2×上样缓冲液：4%（w/v）SDS，2%（w/v）β-巯基乙醇，20%（v/v）甘油，0.2%（w/v）溴酚蓝，溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH6.8）中。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1gTris碱，72g甘氨酸，5g SDS，溶于1000ml 蒸馏水中。

考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于100ml甲醇、水、冰乙酸（9:9:2）混合物中，过滤除去未容物。

脱色液：甲醇:水:冰乙酸=1:7:2的混合物。

3试验方法

单克隆抗体制备技术路线如图1-1。

3.1动物免疫

根据常用免疫学实验技术，采用搅拌混合法，将100μg/ml的400μl抗原溶液与等体积的400μl佐剂充分混合，最终形成“油包水”的乳化状态。初次免疫：用FCA乳化后，每只鼠打4针（腋下腹股沟淋巴结丰富处）每针0.2 ml，即免疫抗原剂量为每只40μg；3周后第二次免疫：用FIA乳化，剂量针数同上；3周后第三次免疫：不加佐剂直接腹腔注射，剂量同上。三免后10d分别尾静脉采血，采用ELISA间接法测其效价，未达到效价要求的继续按三免方式每隔两周免疫一次，直至效价达到1：105。融合前3d加强免疫：50μg OV A抗原量，腹腔注射，3d后取脾融合。