Western Blot 实验实用技术手册总结

Western Blot 实验技术手册

Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一.

一、Western Blot基本操作流程图

细胞/组织蛋白提取

↓蛋白定量、蛋白变性

上样、电泳

↓

一转膜

↓

封闭

↓

孵育一抗

↓洗膜

孵育二抗

↓洗膜

底物孵育

↓

曝光或显色

二.Western Blot操作步骤

1.蛋白提取、处理

蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.

对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.

对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇

动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).，4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀

提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford法、和Lorry法或BCA法，一般推荐用BCA法.

BCA测定方法如下:

A．酶标板操作

2、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工

作液，充分混匀；

3、各孔加入200μL BCA工作液；

4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋

白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

5、稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充

分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

6、根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释

液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/ul）。

三、样品处理

一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加热5-10分钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本混合后变性上样即可，为了减少样品的稀释比例，也可制备4 X或6 X的上样缓冲液，如果上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本1：1混合后变性上样即可. SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。

四、PAGE电泳分离蛋白和转膜、封闭

1）、电泳

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) 。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C 构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，

丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

1-1、阳性对照

目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本

1-2、蛋白分子量Marker

蛋白质分子量Marker的使用，是坚持电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证，

1-3、内参对照

管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。

内参Beta-actin 抗体at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate.