20个测序常见的问题
DNA测序技术的使用中常见问题
DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。
然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。
1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。
低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。
常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。
解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。
- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。
- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。
2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。
然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。
解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。
- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。
3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。
然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。
解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。
选择合适的方法来检测特定类型的突变。
- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。
- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。
4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
基因测序问题总结
（1）Insufficient number of dye spectra detected!
（3）Bad dye order detected.
（4）Saturated data detected.
Байду номын сангаас
（5） q=0.92860 is less than minQ threshold
(2)位点丢失：模板量过低或模板已降解。
(3)小片段位点优势扩增而大片段位点扩增效率低
(4)峰值过饱和
(5)Pull-up峰：
(6) ladder污染?扩增产生？
7.电泳中产生的问题
（1）OL现象
原因：——多个run的Ladder之间相互影响，有聚集 偏移倾向，Ladder峰偏离了Bin，样品峰也偏离了 Bin。这种情况之下将样品和相对应的Ladder重新建 立project，重新分析，如果能对应就不必重新扩增。
(2)变性不完全：甲酰胺质量不好或没有进 行变性
（3）两个等位基因峰合在一起 ——电泳分辨率下降（缓冲液PH值改变或胶时间过长）
下图为正常现象
(4)电泳时出现的尖锐的小峰
不足：（1）衍生峰太高； （2） Ladder中75bp处杂峰 1 在ladder中，箭头所指杂峰容易影响 panal 中ABO基因座的位置 2 Ladder杂峰导致panal 中ABO261座位移动 3 修正后的结果
（6）选择了不适合Dye set的Module
3.染料堆积(Amlogenin、 vWA、D13S317、TH01
位点）
4.不同颜色峰峰高均衡性不好
5. TPOX位点前的非特异性扩增峰
28个循环，chelex提取，滤纸上的血斑和唾液斑
20个测序常见的问题
20个测序常见的问题20个测序常见的问题1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。
2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。
3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。
4．PCR产物直接测序有什么要求？（1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。
如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；(2）必须进行胶回收纯化；(3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。
5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。
大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。
对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。
6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。
使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。
7．PCR产物直接测序的好处？（1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；（2) 省去克隆的实验费用和时间；（3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；（4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。
8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。
测序常见问题分析解答
测序常见问题分析主讲人: 张隽辉LOGO1. 序列结构对测序的影响图例：poly结构原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.图例：重复结构原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些图例：回文结构位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。
图例: 特殊结构现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸解决方法: 酶切,做亚克隆测序2.测序常见图谱分析图例:双克隆1现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体解决办法： 重新挑取单克隆备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一图例:双克隆2现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰解决方法: 重新挑单克隆图例:非特异扩增现象: 峰图起始即双峰 原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合扩增, 换引物或克隆测序图例:等位基因双模板现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序图例：碱基缺失碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的186位缺失两个连续的T。
测序常见问题分析与解答
测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1。
5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序常见问题及其分析-图文
DNA测序常见问题及其分析-图文测序常见问题及其分析CollectedbyRobertoRun,12.10.2022 HTUTUUUTTH1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。
问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。
如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。
解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。
4、polyA/T和C/Gcluter导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
蛋白质测序常见问题汇总
蛋白质测序是一种重要的生物技术，用于确定蛋白质中氨基酸的序列。
以下是一些常见的蛋白质测序问题：
1. 蛋白质测序的目的是什么？
蛋白质测序的目的是确定蛋白质中氨基酸的排列顺序，这对于理解蛋白质的结构和功能非常重要。
通过蛋白质测序，可以了解蛋白质的结构、相互作用以及在生物体内的功能。
2. 常见的蛋白质测序方法有哪些？
常见的蛋白质测序方法包括：Edman降解法、质谱法、同位素标记法、测序仪法和基因测序法等。
3. Edman降解法的基本原理是什么？
Edman降解法是一种常用的蛋白质测序方法，其基本原理是通过化学反应将蛋白质中的氨基酸逐个降解出来，并确定每个氨基酸的位置。
具体来说，该方法包括将蛋白质与苯异硫氰酸酯反应，将氨基酸转化为苯乙酮衍生物，然后将其从蛋白质链上分离出来，再将其转化为对应的氨基酸衍生物。
通过这种方法，可以逐个降解出蛋白质中的氨基酸，并确定其位置。
4. 质谱法在蛋白质测序中的应用是什么？
质谱法在蛋白质测序中扮演着重要的角色。
该方法可以通过对蛋白质进行离子化、裂解和检测其质量，来确定蛋白质中氨基酸的序列。
此外，质谱法还可以用于蛋白质的定量分析、磷酸化位点分析以及蛋白质的结构分析等。
5. 蛋白质测序对于生物科学研究有何意义？
蛋白质测序对于生物科学研究具有重要意义。
通过对蛋白质进行测序，可以了解蛋白质的结构和功能，从而深入了解生物体的生命活动和代谢过程。
此外，蛋白质测序在医学、生物技术和制药等领域也有广泛的应用，例如用于诊断疾病、药物研发和疫苗研制等。
一代测序常见问题及解决策略知识分享
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
常见问题
3.
测序结果
1.我要用什么软件来打开测序文件？ 答：我司的测序结果有以下三种形式文件， （1）.ab1，图谱文件，请使用相关软件打开，相关软件下载请到系统“软件下载”处下载。 （2）.seq，文本文件，可以记事本形式打开。 （3）.txt，文本文件，拼接后的序列都以该形式文件存在。 2.测序结果会在在线系统保留多长时间？ 答：本系统只保留测序文件一个月，请及时下载。 3.为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别? 答：这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序 电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有 20-50bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。 4. 测序结果怎么找不到我的引物序列? 答：如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是 找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始 一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的， 此时需找引物的互补序列。 5.我的测序结果失败了，你们收费吗？ 答：我们只对测序结果标注成功的反应收费，标注失败的反应不收费。 6.我的测序结果为什么会双峰/衰减/弱/无信号？ 答：对于测序结果的异常现象，请参考下表。
信号迅速 衰减或中 断
模板二级结构区后 严重的重复结构 模板质量差 质粒样品：引物不匹配
信号极弱 或无信号
引物不适宜测序 模板量不足
7.我的样品菌液 PCR 检测是阳性的，为什么测序结果是空载？ 答：菌液或菌落的 PCR 检测假阳性率较高，建议做质粒 PCR 检测。 8.测序结果并不是我预期序列，样品是否污染了？ 答：请参考下表。
答：150bp 以下的 PCR 产物纯化和定量都有一定困难，用于测序的 PCR 产物一般不低于 150bp。一个 150bp 的 PCR 产物用于测序，去掉两个引物的序列大约 40 到 50 bp，再加上测序起始端的一些读不好的 碱基，真正能够得到的有用序列不过几十碱基。这只是最理想的假设，这么短片断测序失败的几率非常 大，最佳的方案是克隆后再进行测序。 4.我不清楚我样品的载体用什么通用引物，在你们的载体引物表上也查不到，还有什么方法查询吗？ 答：推荐到 /vector-database/ 查询。Google 也是一个不错的选择。
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
测序常见问题分析
测序常见问题分析测序常见问题分析1.图谱无信号1.1、质粒培养，转化或其他随机原因使质粒上引物序列发生变化，导致无结合位点1.1.1同一模板两端引物测序均无信号，浓度不好安排重抽，反之停止实验，建议客户确认后重新送样1.1.2同一模只一端无信号，确认不是空载体，安排重新实验或换同序列其他引物，两次测序无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通。
反之建议客户单向测通1.1.3客户提供序列我司合成引物，二次实验仍无信号则停止实验，建议客户提供载体图谱或目的基因我处给他设计引物测序1.1.4客户提供序列我司设计并合成引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功则停止实验，请客户确认提供的序列是否和模板相匹配1.1.5我司设计并合成的步行引物核实设计无误可安排重新实验，仍不成功可重设引物或换另一端测通。
1.1.6某一通用引物测序无信号先查看当天该引物的其他实验或近期该引物的实验情况，均无信号则换管引物重新实验，当天该引物的其他实验有成功的，该反应重做1.1.7一订单多样品用同一对引物测序，某条引物测序均无信号，若为客户提供引物则停止实验。
若为通用引物有同序列其他引物，在确认不是空载载体的情况下，安排换引物试作三至四个反应，效果好全部安排用该引物测序；效果不好都停止实验。
客户要求测通的安排单向测通，反之建议单向测通。
1.1.8重摇重抽测序无信号则取消，建议重新提供样品1.1.9客户提供质粒直接测序无信号则停止实验，建议客户提供新鲜菌液1.1.10用PCR引物测序无信号可换备用引物测序，无备用引物停止实验，建议用载体上引物测序。
1.2、PCR 产物1.2.1同一模板两端引物测序均无信号则停止实验，建议客户克隆后测序1.2.2 同一模只一端无信号，安排重新实验, 仍无信号则停止实验，客户要求测通的安排单向测通，反之建议步行测通2. 图谱信号弱可参考原始峰图，对不能出报告的峰图的处理如下：2.1 同一模板某一端，可安排提高浓度梯度重新实验2.2 某一模板或一订单多个模板中的一个模板2.2.1 鉴定浓度正常可安排提高浓度梯度重新实验，效果仍不好可作弱stop处理2.2.2 一次抽提出的质粒亮度弱，可安排重新抽提质粒后测序2.2.3 二次抽提出的质粒亮度弱，可停止实验，建议重新提供样品3 双峰3.1 PCR 产物测序3.1.1 引物不纯，引物客户提供该结果可出，引物我司合成安排重合引物3.1.2 引物特异性差，有双或多结合位点，可换备用引物测序，无备用引物即出结果3.1.3 polyT/A/G/C 出结果，单向建议客户换另一端测序。
DNA测序常见问题解析
DNA测序常见问题解析一．引物问题Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？A：这里分以下几种情况：1. PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。
（1）对于较短的PCR产物（<600 bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。
（2）对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。
由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。
（3）由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。
2. 有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。
3. 找不到克隆片段的扩增引物。
发生这种情况原因有2个：（1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。
比如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序：那么从T7引物末端到 Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。
解决的办法是采用M13 Forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。
（2）您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的反向互补序列。
或者您插入的片段可能不是您的目的片段，而是由于非特异性扩增出来的片段，还有可能您送过来的样品被污染。
Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。
测序常见问题及其分析
图2
解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）
测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化
2、克隆测序时出现峰形重叠
原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染
解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液。
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
测序常见问题分析的解答
测序常见问题分析主讲人: 张隽辉LOGO1. 序列结构对测序的影响图例：poly结构原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.图例：重复结构原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些图例：回文结构位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。
图例: 特殊结构现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序2.测序常见图谱分析图例:双克隆1现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一图例:双克隆2现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆图例:非特异扩增现象: 峰图起始即双峰原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序图例:等位基因双模板现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序图例：碱基缺失碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段， 上图的186位缺失两个连续的T。
一代测序常见问题及解决策略说课讲解
一代测序常见问题及解决策略测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
测序常见问题分析实例
测序常见问题分析实例峰型整齐，在某一点前后突然变乱信号迅速衰减信号极弱或无信号整条序列信号杂乱峰型整齐，在某一点前后突然变乱：图1 PolyT特殊结构上图是我们的一个质粒测序样品，用T7通用引物进行测序，从图中可以看出，在约285bp 的polyT结构后，序列明显变乱。
主要原因是在polyT结构后，测序酶容易在模板上滑动，导致polyT结构后的峰型变得杂乱。
此类样品通过对其反向互补序列进行测序，一般可以得到好的结果。
图2 移码突变双模板的存在上图是我们的一个质粒测序样品，用M13+通用引物进行测序，从图中可以看出，该序列在290bp后序列明显有两套峰存在。
造成该现象的原因可能有如下几条：序列发生缺失突变插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在PCR产物用T载体进行克隆时，PCR片段可以以两个方向克隆进T载体所挑克隆不纯两个大小相近的PCR产物同时存在，无法纯化分开解决的办法：对于质粒模板，重新挑选克隆，或从另一段进行测序对于PCR模板，用另一端引物进行测序，或克隆后进行测序图3 等位基因双模板的存在上图是针对一个质粒进行的测序结果，从图中可以明显看出，在序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，但是没有发生移码突变。
该情况与图2所举的例子有所不同，该情况下从反向进行测序仍然不可能得到好的测序结果。
该种情况下只能采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序。
信号迅速衰减返回图4 CTT重复结构如上图，在大约260碱基后出现了一个严重的CTT重复结构，导致信号迅速衰减，很难得到跨过该区后的信息。
该种情况下，只能从另一端进行测序，一般来说，AAG重复结构不会太影响测序。
也可以对片段进行亚克隆，使每个片段大小不大于200bp，然后再进行测序。
不过，该方法要麻烦很多。
图5 GGT重复结构严重影响测序上图下半部分是一个质粒模板用M13+通用引物进行测序，大约在130bp开始，出现GGT 重复结构，测序信号迅速减弱至消失。
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20个测序常见的问题
1．为什么需要新鲜的菌液？
首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。
2．如何提供菌液？
如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。
3．如何制作穿刺菌？
用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。
4．PCR产物直接测序有什么要求？
（1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。
如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
(2）必须进行胶回收纯化；
(3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。
5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？
如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。
大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。
对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。
6．如何进行PCR产物纯化？
PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。
使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。
7．PCR产物直接测序的好处？
（1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；
（2) 省去克隆的实验费用和时间；
（3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；
（4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。
8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？
对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。
9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？
我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加E，加一个已知浓度的标准样品。
电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。
此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。
质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。
这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。
使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。
10．为什么抽提的质粒最好溶解在ddH2O中？
全自动荧光测序由于反应体系小，所以对于模板DNA的质量要求比手工测序高许多。
通常的提取质粒的试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，我们建议用户不要使用。
因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败。
11．对测序引物的要求有哪些？
对测序引物的一般要求：
(1)特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；
(2)不能含有混合碱基；
(3)长度17-25碱碱；
(4)纯度高，最好PAGE纯化；
(5)用ddH2O溶解，不要用TE溶解。
12．为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？
测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的前提。
如果测序引物在DNA模板分子上有不只一个的结合位点，将造成测序反应过程中引物链在几个结合位点处同时扩增，从而得到链长相同而组成不相同的终止链，测序电泳时收集到重叠峰或乱峰，无法读取序列。
13．为什么测序引物3'端以后有30-50碱基无法读到？
全自动荧光测序方法由于使用标记了大荧光染料的ddNTP，一些未反应完的ddNTP底物会连同测序反应产物一并被沉淀，在测序电泳时会干扰测序信号，导致这部分碱基无法读清。
一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。
通常这也是载体的序列。
所以选取测序引物时要使引物3'端离开要求测序的起始位置50bp以上比较合适。
而对于PCR产物测序就不可避免使得测序引物区域附近无法读到数据。
14.为什么在测序报告上找不到引物序列？
有如下几种情况:
（1）找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为荧光测序方法采用的是荧光标记了的ddNTP，自动测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列。
由于引物本身是不被标记的，所以在测序结果中也是找不到的。
（2）找不到克隆片段的扩增引物。
原因可能是您在构建质粒时所用的酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分判读不清。
（3）还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时可以找一下引物的互补序列。
（4）存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
15．什么是Primer Walking 测序？
大于片断较大的样品，双向测序如果不能完全拼接，我们还可以为用户按照上一个测序结果在一定的位置左右设计引物继续测序，并将测序结果拼接，即Primer Walking 测序。
16．超过6Kb的DNA片断如何进行测序？
超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间，Shot Gun方法如下：（1）用物理方法打碎DNA；
（2）回收1～1.5Kb的片断；
（3）用核酸酶切平端，连接入载体；
（4）按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据；
（5）编辑所有测序数据；
（6）如果有缺少数据的区域，还需要补充测序。
拼接成完整序列。
17.为什么测序结果完全不是所需的序列？
出现这样的情况只有两种可能：
（1）我们给您的测序结果对应的不是您的样品；
（2）您的样品插入部分与您预期的不一致。
这时需要双方将样品进行验证（PCR和酶切鉴定）。
18.样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么测序结果是一个空质粒？
测序是对样品的最好验证.结果为空载，可能如下：
（1）可能在培养过程中发生插入片段的丢失，由于这种情况的发生无法事先预期到；（2）提供的克隆是假阳性克隆。
19.为什么到重复序列时（PloyA,T,C,G）后面信号几乎都较乱？
重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。
测序级的酶遇到连续的重复碱基的时候，对模板的判读就会出现打滑现象，导致后面的序列无法判读。
这样的情况，建议反向测序。
20．全自动荧光测序的准确性如何？
我们有两种不同型号的测序仪：ABI377和ABI3730
ABI377测序仪采用配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，该测序方法以及安装仪器时用标准样品测试，准确性达到一个反应500碱基中只有1个以下的错误(即错误率小于0.05%)。
如果用户得到一个测序结果的彩图是清晰的，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码是一致的，那么它的准确性应该是可信的。
当然如果是新序列，最好用同方向或反方向再测序一次加以验证。
因为两次不同的测序，同一个碱基上的错误概率应该小余0.0025%。
同时出错的可能性极小。
ABI3730测序仪也是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其准确性达到800碱基只有1个一下的错误，并且该测序仪对碱基的判读有一个自身的评判值（Quality Value），根据QV值的大小，也可以帮助我们来判断每一个碱基的准确程度。