生物学讲稿

1）Southern印迹杂交原理
将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性 内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因 片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电 泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝 胶上。
用碱处理凝胶，使各酶切片段在凝胶上原位变 性，利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转 移到固相膜上，各片段在固相膜上的相互位置与 在凝胶上相同，实现所谓的原位印迹。
Notice: 限制性内切酶是保存在50％的甘油中， 如果酶切反应体系中甘油浓度超过5％，则会引 起限制性内切酶专一性改变，产生星活性。
③ 酶切效果检验
酶切体系及条件是否合适，需通过检测酶切效 果来确定。
酶切充分的植物DNA产生若干大小不同的片段。 将酶切样品用0.7％或0.8％的琼脂糖凝胶分离， 电泳后在紫外灯下观察，酶切效果好的样品应 呈现出一条连续的，荧光由深至浅的均匀条带 (高分子量区深，低分子量区浅) 。
通过特异性扩增条带的有无及其分子量的大小 可对外源基因是否整合做一初步判断。
2 Southern斑点杂交
斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因Fra Baidu bibliotek组内是否含有外源基因。
操作过程：植物总DNA或基因组DNA不经限制性 内切酶酶切，直接点在固相膜上。点样前DNA样 品需经变性处理，一般做法是采用NaOH碱变性， 也可以通过煮沸变性。轻微洗膜除去盐后进行 固定，以后的操作与印迹杂交相同。
斑点杂交的主要问题是假阳性率较高。
3 Southern印迹杂交
斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体 DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能 反映外源基因整合的更多信息。
Southern印迹杂交由Southern于1975年建立， 用来检测经限制性内切酶切割的植物DNA片段 中是否存在与探针同源的序列，并可分析外源 基因在植物染色体上的整合情况，如拷贝数、 插入方式以及外源基因在转化植株Fl代中的稳 定性等问题。
一、外源基因整合分子生物学鉴定
外源基因整合的分子生物学鉴定主要 有 PCR 扩 增 、 PCR-Southern 杂 交 、 Southern杂交以及Southern原位杂交和 FISH等。
1 利用PCR扩增检测外源基因整合
※ 以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计 引物进行扩增。
※ 琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，若被检植株基 因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物， 琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。反之， 非转化植株无特异性扩增条带出现。
漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离 的探针。
最后根据探针的标记性质进行检出，特异 性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示 出来。
2）Southern印迹杂交的实验样品
实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA 样品及待检转化植株总DNA样品。
※阳性对照样品：①含被检的外源基因的中间载体质粒 DNA；或②农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA；或③农杆菌 双元载体小质粒DNA。 ’
印迹方法
第一、毛细转移法：该方法是利用干燥吸水 纸的毛细作用进行转移。
第二、电转移法：电转移法是利用电泳的原理， 凝胶上的DNA片段在电场作用下脱离凝胶，原 位转至固相支持物上。
第三、真空转移法：真空转移原理是利用真空 作用造成流经凝胶的液流，使凝胶中的DNA片 段洗脱出来而沉积在凝胶下面的固相支持物上。
※阴性对照样品：用相同方法提取的非转化植株总DNA。
※ 分 子 量 标 准 DNA 样 品 ： DNA／ HindⅢ 、 或 DNA／ HindIII+EcoR I。
※被检样品：各转化克隆植株总DNA。
3）Southern印迹杂交的实验程序
Southern印迹杂交需要依次完成如下8个实验步 骤：①植物总DNA的限制性酶切；②凝胶电泳 分离各酶切片段；③各酶切片段于凝胶中原位 变性；④将凝胶中变性的DNA片段转移到固相 膜上；⑤预杂交，掩盖非特异性位点；⑥探针 与膜上同源DNA片段杂交；⑦漂洗去除未结合 的及非特异性结合的探针；⑧杂交体检出。
经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与 固相膜牢固结合。
经预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点 后，将膜放入含有单链或经变性处理成为单链探 针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。
膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补 作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应 位置上。外源基因与探针同源，凡含有外源基因 序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异 性杂交体。
④ 凝胶中的DNA变性
Southern杂交必须是单链探针与单链同源 DNA片段结合，因而凝胶上的双链DNA片段必 需经变性处理，使之成为单链。通常采用碱变性， 将凝胶浸泡在0.5mol／L NaOH、1.5mol/L NaCl 溶液中，室温下于脱色摇床上轻摇，其间可更换 一次变性液以使DNA充分变性，注意胶不要浮 在液面上。
各程序中有关问题阐述如下：
① 植物总DNA的限制性酶切
* 限制性内切酶的选择 多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切，
也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成 的DNA片段可提供出与探针杂交所需的足够信 息，即限制片段中必须含有整个探针序列。
② 酶切反应体系
* 植物DNA的用量一般在5～15µg； * 酶切体积为20一50µl； * 酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般 为5～10U/µg DNA。
⑥ 预杂交
*预杂交：预杂交是在加入探针前用封闭剂封闭 膜上的非特异性位点。由于固相膜对单链DNA 有很强的结合力，所以膜不仅能与印迹过去的样 品DNA结合，而且也能与探针结合。在印迹后 的膜上，除样品占据的位置外还有空余，如不将 这些空余部位封闭，探针就会被结合，掩盖了特 异性杂交。
⑤ 印迹
Southern杂交是杂交液中的探针与固定在固相 支特物上的同源序列进行的固—液杂交。固相支 持物也称固相膜或简称为膜。将凝胶上的变性 DNA片段原位转移到固相支持物上的过程称为 印迹。为满足印迹及杂交操作的要求，固相膜必 需具有如下特点：
①能很好地与DNA分子结合，要求每平方厘米 能结合10µg以上的DNA，同时又不影响DNA片 段与探针杂交，②对探针及其它物质的非特异性 吸附小，③具良好的机械性能。