实验四酵母核糖核酸的分离与组分鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定酵母RNA是由酵母细胞合成的核糖核酸，包含了酵母细胞的遗传信息，并参与了细胞的生理代谢过程。
本实验旨在通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取，纯化酵母RNA，并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳等方法对酵母RNA进行组分鉴定。
一、材料与方法1.材料酵母细胞、DTT、Tris、EDTA、NaCl、硝酸、醋酸等。
2.方法1)制备样品a.在液氮中将酵母细胞粉磨成细粉；b.称取10mg酵母细胞粉末加入1ml去离子水中，振荡混匀，制成1mg/ml的酵母细胞悬液。
2)离心分离a.取1ml稀释后的酵母细胞悬液，离心10000rpm/10min，弃去上清液；b.用10μl无菌去离子水重悬沉淀，制成1mg/ml的RNA悬液。
3)RNA的提取和纯化a.取1ml离心沉淀物加入700μl去离子水，混合均匀，加入100μl10%SDS和100μl 酸性酚(pH4.5)混合，振荡15min；b.加入300μl氯仿，振荡混合，离心12,000g/10min；c.取上层水相(约600μl)，加入等量异丙醇混合，振荡；d.离心12,000g/5min，弃去上清液，将胶状RNA沉淀用70%酒精重悬，制成1mg/ml的RNA溶液。
4)鉴定RNAa.测定RNA含量和纯度b.通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。
c.用紫外吸收光谱测定RNA吸收光谱曲线。
5)结果分析a.通过鉴定RNA的吸收峰和电泳图谱来分析RNA组分。
二、实验结果1.酵母RNA提取和纯化效果良好，制得1mg/ml的RNA溶液。
2.根据紫外吸收光谱结果，可以看到RNA在260nm的吸收峰高于280nm，证明纯化后的RNA具有良好的纯度。
3.琼脂糖凝胶电泳显示，RNA溶液中有一个清晰的28S条带和一个模糊的18S条带，证明RNA转录水平较高。
三、讨论和结论通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取纯化酵母RNA，可以得到高质量和高纯度的RNA样品。
此外，琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱可以对RNA组分和质量进行鉴定，为后续的RNA研究提供了有价值的基础数据。
酵母rna的提取与鉴定实验报告
4. RNA含量的测定
- 使用紫外分光光度计测定RNA在260nm处的吸光度- 根据标准曲线计算RNA浓度
- OD260值：- 标准曲线方程：- RNA浓度（μg/ml）：
- 测定结果的准确性和可靠性- 与标准RNA液的浓度对比
- 酵母粉质量：- 沸水浴时间：- 离心转速和时间：- 乙醇体积和洗涤次数：
- 提取的RNA沉淀量（通过观察或称重）- 提取过程中可能的损失和干扰因素
3. RNA的纯化
- 使用特定试剂（如异硫氰酸胍-苯酚-氯仿）进行抽提- 或根据RNA在等电点的pH环境下溶解度最小进行纯化
- 纯化试剂的种类和用量：- pH调节范围和纯化时间：
- 分析实验结果的可靠性和准确性- 讨论可能的误差来源和改进措施
7. 结论与展望
- 总结实验过程和结果，得出实验结论- 提出改进方法和未来研究方向
- 实验结论：- 改进建议：- 未来研究方向：
- 对实验结果的全面评价- 对未来研究的展望和建议
5. RNA的鉴定
- 进行磷酸的检测、核糖的显色反应以及嘌呤碱基的检测等化学反应- 观察颜色变化或生成物
- 磷酸检测结果：- 核糖显色反应结果：- 嘌呤碱基检测结果：
- 鉴定结果的准确性和可靠性- RNA组分的完整性和稳定性
6. 数据整理与分析
- 整理实验数据，计算RNA的纯度、提取率和产率等
- RNA纯度（%）：- RNA提取率（%）：- 总制品重量和产率：
rna的提取与鉴定实验报告
实验步骤
操作细节与试剂
数据记录
结果与分析
1. 实验准备
- 仪器：紫外分光光度计、离心机、水浴锅等- 试剂：酵母粉、NaCl、HCl、乙醇、氨水、RNA沉淀剂等
酵母核糖核酸的提取及测定
酵母核糖核酸的提取及测定酵母核糖核酸的提取及测定⼀、实验背景及⽬的核糖核酸(RNA)和它的降解物核苷酸、核苷及其衍⽣物在⽣物化学、医药、⾷品添加剂、农业等领域有着⼴泛的应⽤。
⽐如能够促进作物的⽣长，在⽔稻、⼩麦、柑橘及多种蔬菜⽣产中应⽤，取得了明显的增产效果。
像鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)还是强⼒助鲜剂，胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为⽣产治疗癌症、肝炎及冠⼼病等药物的原料。
⽽利⽤微⽣物资源提取氨基酸、核苷酸等⽣物⼩分⼦，具有成本低、⾮化学合成、⽆毒、⽆害的特点。
[1] 随着啤酒等发酵⾏业的快速发展，产⽣了相应的⼤量发酵副产物，如何利⽤这些副产物，既做到不污染环境，还能产⽣良好的经济效益，⼀直是研究的热点。
⽽啤酒废酵母中RNA 含量达6%~8%，是⽣产RNA的较好原料，此外，抽提后的菌体蛋⽩质(占⼲菌体的50%)还具有很⾼的利⽤价值。
所以利⽤啤酒废酵母⽣产RNA形成了⾮常有益的产业链。
[2] 本实验⽬的就是学习从酵母中提取RNA的⽅法并掌握其测定⼿段。
⼆、实验原理微⽣物是⼯.业上⼤量⽣产核酸的原料，其中以酵母最为理想，酵母核酸中主要是RMA (2.67~10.0%)，DNA很少(0.03~0.516%)，菌体容易收集，RMA也易于分离。
RMA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋⽩质分离，然后将菌体除去，再根据RNA等电点在pH2. 0~2.5的特点，将体系pH调⾄其等电点，使之沉淀，进⾏离⼼收集。
提取RNA的⽅法很多，在⼯业⽣产上常⽤的是稀碱法和浓盐法。
稀碱法利⽤碱使细菌细胞壁⽔解，使RNA释放出来，浓盐法是在加热条件下，利⽤⾼浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，RNA 钠盐易溶于⽔，在含盐的菌体溶液中，RVA 有较⾼的溶解度。
⼆者均通过控制温度使蛋⽩质变性沉淀，通过离⼼将RNA及蛋⽩质和酵母菌体分离，进⽽在等电点沉淀RNA，从⽽达到提取⽬的。
本实验采⽤浓盐法(10% NaCl),是⾷品医药卫⽣领域制备RNA 制剂的经典⽅案。
生化实验 酵母RNA的提取及组分鉴定
Exit
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验原理
⑵ 核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核
生 物 化 学 实 验
糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化
下生成鲜绿色复合物。脱氧核糖与二苯胺试剂反应成蓝色
化合物，而核糖无此反应。 地衣酚鉴定戊糖时特异性较差， 凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有 干扰作用，在试剂中加入适量CuCl2· 2H2O可减少DNA的干扰， 甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚
酵母RNA的提取及组分鉴定
二.水解RNA 生 物 化 学5mol/L硫酸溶液
10ml，在沸水浴中加 热10min制成水解液并 进行组分的鉴定。
Exit
生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定 三、RNA组分鉴定
1.嘌呤碱：取一支
生 物 化 学 实 验
试管，加入水解液
1ml ，浓氨水2ml ， 5％的硝酸银溶液 1ml，观察有无白色 嘌呤碱基的银化物
2.将悬浮液转移至
150ml锥形瓶中，在沸 水浴上加热30分钟，冷 却至室温，离心 （4000r/min）15分钟。
生命科学学院
酵母RNA的提取及组分鉴定
3.将上清液缓缓
倾入30ml乙醇溶
生 物 化 学 实 验
液中，注意要一 边搅拌一边缓缓 倾入。加毕用冰 醋酸调pH至2.5，
静置，等核糖核
酸沉淀完全后，
酵母RNA的提取及组分鉴定
实验原理 生 物 化 学 实 验
酵母含RNA,2.62---10％,DNA含量仅为0.03-0.516%，所 以提取RNA多以酵母为原料。 RNA用硫酸水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基. ⑴ 强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵 试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵[(NH4）3PO4· 12MoO3】。 （黄色沉淀） PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3PO4· 12MOO3· 6H2O↓+6H2O （黄色）。 ⑵定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被 还原成MO4+，此4价钼再与试剂中的其他MO42-结合成MO（MOO4） 2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的 深浅和磷含量成正比，可用比色法测定RNA的含量。
实验四 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
三、器材
锥形瓶 大研钵 电子天平 离心机 恒温水浴锅
注意仪器使用方法 离心管平衡!!
2010版
四 NaOH,95%乙醇,1.5 M H2SO4溶液,浓氨水,0.1M AgNO3 酸性乙醇溶液：30ml95%乙醇加0.3ml浓盐酸混匀。 苔黑酚--FeCl3溶液：将100 mg苔黑酚溶于100ml浓HCl中,再 加入100mgFeCl3.6H2O，临用时配制。 定磷试剂： 按顺序以A：B：C：蒸馏水＝1：1：1：2（V/V）混匀,现配。 A、17% H2SO4： 将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。 B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸 馏水中。 C、10%Vc：10g Vc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜 色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。
2010版
五、操作
1、酵母RNA的提取(2-3人一份) 将4g酵母溶于20ml0.04 M NaOH溶液中（先以少量 NaOH溶液湿润酵母，并充分研磨)， 将悬浮液转移 到250ml锥形瓶中，在沸水浴30分钟，不时搅拌,冷 却后转入离心管进行离心 . ----（蛋白质变性沉淀，RNA溶于
碱性溶液）
五、操作
2、RNA水解液的制备： 取200mg 提取的核酸，加入1.5 M H2SO4 10ml ， 在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分 的鉴定。 3、RNA组分的鉴定： ① 嘌呤碱：取水解液1ml加入过量的浓氨水，然后 加入约1ml 0.1 M AgNO3溶液 观察溶液的变化。 ② 核糖：取1支试管加入水解液1ml，加苔黑酚-FeCl3溶液１ml，放沸水浴中10分钟，注意溶液颜 色的变化。 ③ 磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂 1ml，在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。
《生物化学实验》教学课件—23 酵母RNA的分离及组分鉴定
3、沉淀用95%乙醇洗2次，每次10mL搅拌沉 淀，离心，沉淀为粗RNA。 4、向上述含有RNA的离心管内加10%H2SO4 5mL，加热煮沸1~2min，将RNA水解。
生物化学实验技术
①核糖：取水解液0.5mL，加苔黑酚试剂1mL， 加热至沸1min，注意溶液是否变绿 ②嘌呤碱：取水解液2mL，加入氨水2滴及 5%AgNO31mL，观察是否有絮状嘌呤银化物 产生 ③磷酸：取水解液1mL，加入定磷试剂1mL， 观察溶液是否呈蓝色。
生物化学实验技术
酵母RNA的分离及 组分鉴定
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
1、掌握酵母RNA提取的方法。 2、了解核酸的组成。 3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。
生物化学实验技术
二、实验原理
酵母中RNA含量可达酵母干重的 2%~10%，DNA则少于0.5%。RNA可溶于碱 性溶液，用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解， 然后用酸中和，离心除去蛋白质和菌体后，上 清液用乙醇沉淀，由此可得RNA的粗制品。 RNA由核糖、碱基和磷酸组成，加入硫酸煮 沸后可使其水解，从水解液中可对上述组份进 行分别鉴定。
③嘌呤碱：嘌呤碱与AgNO3能产生白的嘌 呤银化物沉淀。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：三角瓶、沸水浴、量筒、滴管、试 管及试管架 、烧杯 、离心机。 2、试剂：0.2%NaOH氢氧化钠溶液，乙酸， 95%乙醇，10%硫酸溶液，浓氨水，5%硝酸 银溶液，苔黑酚（地衣酚）试剂，定磷试剂。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成 无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷 酸铵（黄色沉淀）。当有还原剂存在时，磷酸 铵立即转变成蓝色的还原产物——钼蓝。
酵母核酸实验报告
一、实验目的1. 掌握酵母核酸提取的方法。
2. 了解核酸的组成和性质。
3. 学会鉴定核酸组分的方法和操作。
二、实验原理酵母核酸主要由RNA和少量DNA组成。
RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，从而得到RNA制品。
DNA则不易溶于乙醇，可以通过进一步处理分离。
本实验主要关注RNA的提取和鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酵母粉、NaOH溶液、乙醇、硫酸、三氯化铁、苔黑酚乙醇溶液、硝酸银溶液等。
2. 实验仪器：研钵、研杵、烧杯、试管、离心机、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、沸水浴锅等。
四、实验步骤1. 酵母RNA提取（1）称取1g干酵母于研钵中，加入少许石英砂，再加入2ml 0.04mol/L NaOH溶液，在研钵中充分研磨至少5min。
（2）再加4ml 0.04mol/L NaOH溶液于匀浆液中，混匀后，将匀浆液转移到大试管中，再用4ml 0.04mol/L NaOH溶液洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。
（3）将大试管小心在沸水浴中加热30min，冷却后倒入离心管中，与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡，然后两组的离心管对称地放入离心机中，2000r/min 下离心15min。
（4）吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中，将离心管上清液小心倒入小烧杯中，边倒入边搅拌，直到RNA沉淀完全。
（5）将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管，平衡、离心（2000r/min）3min。
（6）弃去两离心管上清液，各离心管中加入95%乙醇，混匀后，再次离心（2000r/min）3min。
（7）弃去上清液，用无菌滤纸吸干沉淀，晾干备用。
2. 酵母RNA鉴定（1）嘌呤碱鉴定：取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。
（2）核糖鉴定：取1支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。
放沸水浴中10分钟。
注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
酵母核糖核酸
实验六：酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的：了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、原理：酵母核酸中RNA含量较多。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、主要器材： 1．水浴2、离心机四、试剂和材料1．0.04 mol/L氢氧化钠溶液2．酸性乙醇溶液3．95%乙醇5．1.5 mol/L硫酸溶液6．浓氨水7．0.1 mol／L硝酸银溶液8．氯化铁浓盐酸溶液9．苔黑酚乙醇溶液10．定磷试剂11．酵母粉五、操作：将1g酵母悬浮于10mL 0.04 mol／L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。
将悬浮液转移至玻璃试管内。
沸水浴加热30分钟，冷却后移入到离心管内，离心(3000r/min)10分钟，将上清液缓缓倾人10mL酸性乙醇溶液中。
注意要一边搅拌一边缓缓倾人。
待核糖核酸沉淀完全后，移入离心管内，再离心(3000r/min)5分钟。
弃上清液。
用95%乙醇离心洗涤沉淀1次，弃乙醇后，得RNA沉淀。
将RNA沉淀从离心管内转移到一只试管中，然后向试管内加入1.5 mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟，制成水解液，通过下述实验进行组分鉴定：1、嘌呤碱做三组对照实验：取3支试管分别进行如下操作（1）水解液1mL＋浓氨水1mL＋0.1 mol/L硝酸银溶液1mL，有无嘌呤碱的银化合物沉淀？（2）浓氨水1mL＋0.1 mol/L硝酸银溶液1mL，有无沉淀？（3）水解液1mL＋0.1 mol/L硝酸银溶液1mL，有无嘌呤碱的银化合物沉淀？2、核糖：取1支试管，水解液1mL ＋三氯化铁浓盐酸溶液2mL ＋苔黑酚乙醇溶液0.2 mL，沸水浴中3分钟。
注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
3、磷酸：取1支试管，水解液1mL ＋定磷试剂1mL，在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。
生化实验课件-酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 (2)
核苷酸的消化和核酸一樣。此外嘌呤類核苷
酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小時脫磷；
嘧啶類核苷酸可用10mol/L H 2 SO4消化1—2個小
時脫磷。
二，試劑
1.標準磷試劑（含磷5μg/ml）:準確稱取恒重
（105℃ ）的 KH 2 PO4 0.4389g,用水定容到100ml，此液
3. 催化劑：硫酸銅（ CuSO4 •5H 2O）：硫酸鉀
（ K 2 SO4）=1：4（W/W）,研成細末。
4. 30%過氧化氫，濃硫酸
三，操作方法
1.製作磷標準曲線：
取標準磷酸溶液（ 5μg/ml ）0，0.5，1.0，1.5，2.0，
2.5，3.0ml，用水補足到3ml，含磷量分別為0，2.5，5，
3.磷酸：取一支試管，加入水解液1ml和定磷試劑 1ml。在水浴中加熱，觀察溶液是否變成藍色，說明磷 酸是否存在。
離心機使用及注意事項
使用方法:
1 ．接通電源 2 ．平衡離心樣品 3. 加入樣品, 關蓋 4 ．設置時間 5．調節轉速 6. 關機, 開蓋, 取出樣品
注意事項:
（1）離心前必須仔細檢查轉頭各孔內有無異物。 （2）離心管必須仔細平衡。 （3）機內若不清潔，離心管要封口。 （4）必須慢啟動，然後加速。 （5）離心時不准開蓋。 （6）不准用手刹車。
1000ml 500ml 1000ml 500ml 200ml 50ml 50ml 80ml 10ml
11. 定磷試劑
50ml
（1）17%硫酸：將17毫升濃硫酸（比重1.84）緩緩 加入到83毫升水中。
（2）2.5%鉬酸銨溶液： 2.5g鉬酸氨溶於100ml水中。
（3）10%抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶於100ml水 中，貯存棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時可用，如呈深 黃色或棕色則失效，需要純化抗壞血酸。
酵母RNA的提取测定及组分分析
实验三酵母RNA的提取、测定及组成成分的分析Ⅰ酵母RNA的提取——浓盐法【目的和要求】了解用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法【基本原理】核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。
因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采取温和的条件，例如避免过酸碱，避免剧烈的搅拌，防止核酸降解酶类的作用。
由于RNA种类较多，所以制备方法也各异。
工业上制备RNA一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。
稀碱法是用1%NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸中和，升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点(pH2.5)，使RNA沉淀出来。
稀碱法的优点是抽提时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解。
浓盐法是用10%NaCL溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
用浓盐法提取RNA，则就注意掌握温度，避免在20～70℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA因降解而降低提取率。
利用加热至90～100℃，使蛋白质变性，破坏该酶类，有利于RNA的提取。
若要提取接近天然状态RNA，可采用苯酚法或氯仿-异戊醇法去蛋白，然后用乙醇沉淀RNA。
离心收集。
本实验采用浓盐法（10% NaCL）【操作方法】1．提取称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。
加10% Nacl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小时。
2．分离将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。
3．沉淀RNA将离心得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于放有冰块250mL烧杯中冷却。
待溶液冷至10℃以下时，在搅拌下小心地用6mol/L HCL溶液调节pH至2.0～2.5。
随着pH值的下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH值）。
调好后继续于冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析
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①磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 (1mL $ + 1mL定磷试剂)：
(NH4)2MoO4 + H3PO4 → (NH4)3PO4·12MoO3↓(黄色)
Mo6+
SnCL2
Mo4+
Mo(MoO4)2 (兰色)
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② 核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色 (1mL $ + 1mL FeCl3 + 2mL orcin→水浴加热)
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OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计 去盐的程度。
对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于 2。
OD260/OD230<2说明去盐不充分, 可以再次沉淀和70%乙醇洗 涤。
浓度计算： DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000
当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml
纯DNA：OD260/OD280≈1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0 （＜1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚 /氯仿抽提）
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5.RNA的组分鉴定
①RNA的酸解 将装有待测RNA的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明 为止，得到RNA的水解液，期间不停晃动，以使受热均 匀。
酵母核糖核酸的提取及测定
二、 研究依据及原理：
酵母作为工业上大量生产核酸的最为理想的微生物，因为酵母 核酸中主要是 RNA（2.67~10.0%） ，DNA 很少（0.03~0.516%） ，菌体 容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质，也具有 很高的利用价值。 RNA 提取过程是先使 RNA 从细胞中释放， 并使它和蛋白质分离， 然后将菌体除去，再根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将 pH 调 到 2.0~2.5 使 RNA 沉淀，进行离心收集。 提取 RNA 的方法很多， 在工业生产上常用的是稀碱性和浓盐法。 本实验采取浓盐法（10%NaCl） 核酸不论是 DNA 还是 RNA，都是由核苷酸组成的多聚核苷酸 化合物，而核苷酸是由糖，碱基和磷酸构成。 要测定生物体内核酸的含量或者测定提取出来的核酸含量，只
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需要测定组成核苷酸的一种成分，如磷，糖或碱基，便可计算出核糖 的含量，因为核算分子中这三个组份是以等分子比例存在的，即每一 个嘌呤或嘧啶分子都与一分子戊糖及一分子磷酸相连接的， 所以只要 测出其中任何一组分的含量即可求出核糖的含量。 本实验采用紫外吸收法测定核糖核酸含量，因为核酸的组成成 分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，最大吸收在 260mm 处，利 用此特性可以对核酸进行定量测定。
E 260 A 260
（1） RNA 含量（%）=
实验四酵母核糖核酸的分离与组分鉴定
【原理】
核糖核酸含有核糖、碱基（嘌呤碱、嘧啶碱）和 磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上 述组分的存在。
磷酸+钼酸铵 → 磷钼酸铵↓
核糖+地衣酚试剂→ 墨绿色化合物
嘌呤碱+硝酸银→ 嘌呤银化物（白色）
【试剂和器材】
器材
研钵 刻度试管、普通试管 刻度离心管 搅拌棒 量筒、移液管、滴管 恒温水浴锅 台式离心机
实 验 四
酵母核糖核酸的分离 与组分鉴定（P159）
【目的】
掌握分离核糖核酸的一般原理及操作方法
了解核酸的组分，掌握鉴定核酸组分的方
法
【原理】
酵母核酸中RNA含量较多； 一般提取的RNA主要是rRNA，与蛋白结合在一起形 成核糖核蛋白（RNP）； RNA溶解性：溶于水，溶于稀酸、稀碱溶液，不溶 于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂； RNA的等电点在2.0-2.5，DNA的等电点在4.2左右； 碱提法、盐提法 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核 糖核酸沉淀，由此得到RNA的粗制品。
【试剂和器材】
试剂
酵母片 0.04mol/LNaOH溶液 1.5mol/LH2SO4溶液 冰醋酸 浓氨水
95%乙醇 0.1mol/LAgNO3溶液 三氯化铁浓盐酸溶液 苔黑酚乙醇溶液 定磷试剂
【实验方法】 （一）RNA的提取
3片干酵母片 于研钵中充分研磨 放入刻度试管 加0.04mol/LNaOH 10mL 沸水浴加热30min(搅拌) 取出加乙酸4滴，使 提取液呈酸性 静置5min 2500rpm,离心5min,弃上清 沉淀即为RNA粗制品 2500rpm,离心15min,弃沉淀 取上清加入等体积95%乙 醇，边加边搅拌
酵母RNA的提取和组分鉴定
酵母RNA的提取一、实验目的1、掌握酵母RNA提取的方法。
2、了解核酸的组成。
3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。
二、实验原理三、实验步骤1、用托盘天平称1g干酵母于研钵中，加入少许石英砂，再加入2ml 0.04mol/LNaOH溶液，在研钵中充分研磨至少5min。
2、再加4ml 0.04mol/LNaOH溶液于匀浆液中，混匀后，将匀浆液转移到大试管中，再用4ml 0.04mol/LNaOH溶液洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。
3、将大试管小心在沸水浴中加热30min，冷却后倒入离心管中，与另一组同学的离心管在托盘天平上平衡，然后两组的离心管对称地放入离心机中，2000r/min下离心15min。
4、吸取10ml酸性乙醇溶液于小烧杯中，将离心管上清液小心倒入小烧杯中，边倒入边搅拌，直到RNA沉淀完全。
5、将小烧杯中的液体倒入2个干净的离心管，平衡、离心（2000r/min）3min。
6、弃去两离心管上清液，各离心管中加入95%乙醇2.5ml，振荡、混匀、平衡、离心（2000r/min）3min。
7、弃去两离心管上清液，各离心管加入3ml 1.5mol/L硫酸，混匀、倒入同一个大试管中，贴上标签，放在试管架上，备用。
8、将水解液在沸水浴中加热至少10min，使沉淀RNA充分水解。
9、取一支试管A，加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，再逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入1ml水解液放置片刻，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。
10、另取一支试管B，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和地衣酚乙醇溶液0.2ml（约4滴），混匀，用试管夹夹好后放到沸水浴中3~5min，注意观察溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
11、再取一支试管C，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，混匀，在沸水浴中加热，注意观察溶液颜色的变化，溶液变蓝，说明磷酸存在。
注意事项：离心一定要平衡对称放入离心机中，离心机达到设置转速时才能离开。
酵母的提取及组分鉴定
了解RNA提取的原理，掌握RNA组分鉴定的 方法
二、实验原理
酵母细胞中所含的核酸主要是RNA,DNA含量很 少，故本实验采用酵母提取RNA。由于酵母细 (一) 酵母研磨要充分；
嘌呤试验：3号管，取5% AgNO3 10滴，加氨水2-3滴（至沉淀消散后），再加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热约5～10min，观 察颜色变化。
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微生物实验十七、酵母RNA的提取及组份鉴定
微生物实验十七、酵母RNA的提取及组份鉴定一、实验目的1. 了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。
2. 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。
3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。
二、实验原理核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。
因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。
酵母核酸中RNA含量较多，RNA达2.67-10.0%,而DNA含量仅为0.03-0.516%,酵母核酸的提取方法较多,工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。
稀碱法是用1% NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸中和,升高温度使蛋白质变性,将蛋白质与核酸分离,然后除去菌体,将pH 调至RNA 的等电点（pH2.5）,使核酸沉淀出来。
稀碱法的优点是抽提时间短,但核酸在此条件下不稳定,容易分解。
血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物,是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。
其型号分为XB.K.25.和XB.K.16. 两种,前者是一个大方格分成25 个中方格,而每个中方格又分成16 个小方格；后者为一个大方格分成 1 6个中方格,而每个中方格又分成25个小方格。
但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。
每一个大方格边长为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3 （万分之一毫升）。
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。
一般在OD260nm波长下，每毫升含1⑷RNA 溶液的吸光值为0.022。
故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。
此法操作简便，迅速。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
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核糖：1mL水解液+2mLFeCl3-HCl+0.2mL苔 黑酚乙醇，沸水浴3min，观察溶液有无墨绿色 出现。
磷 酸 ： 1mL 水 解 液 +1mL 定 磷 试 剂 ， 沸 水 浴
3min，观察溶液中有可编无辑版 蓝色沉淀生成。
8
【结果与分析】
说明各试管中现象 解释原因 得出结论
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液
苔黑酚乙醇溶液
冰醋酸
定磷试剂
浓氨水
可编辑版
6
【实验方法】 （一）RNA的提取
3片干酵母片 于研钵中充分研磨 放入刻度试管
2500rpm,离心15min,弃沉 淀
取上清加入等体积95%乙 醇，边加边搅拌
加0.04mol/LNaOH 10mL 沸水浴加热30min(搅拌)
取出加乙酸4滴，使 提取液呈酸性
静置 5min
2500rpm,离心5min,弃上 清
沉淀即为RNA粗制
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品
7
【实验方法】（二）RNA的组分鉴
定
RNA粗制品+ 5mL1.5mol/LH2SO4，沸水浴加 热10min，制成水解液。
组分鉴定
嘌 呤 碱 ： 1mL 水 解 液 +5 滴 浓 氨 水 + 1mL0.1mol/L AgNO3，观察有无白色絮状嘌 呤银化物沉淀。
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4
【试剂和器材】
器材Biblioteka 研钵 刻度试管、普通试管 刻度离心管 搅拌棒 量筒、移液管、滴管 恒温水浴锅 台式离心机
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5
【试剂和器材】
试剂
酵母片 0.04mol/LNaOH
溶液
95%乙醇 0.1mol/LAgNO3溶
液
1.5mol/LH2SO4溶 三氯化铁浓盐酸溶液
实验四 酵母核糖核酸的分离 与组分鉴定（P159）
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1
【目的】
掌握分离核糖核酸的一般原理及操作方法 了解核酸的组分，掌握鉴定核酸组分的方
法
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2
【原理】
酵母核酸中RNA含量较多； 一般提取的RNA主要是rRNA，与蛋白结合在一
起形成核糖核蛋白（RNP）； RNA溶解性：溶于水，溶于稀酸、稀碱溶液，不
9
【讨论与心得】
RNA提取实验过程中各操作步骤的作 用是什么？
心得
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10
溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；
RNA的等电点在2.0-2.5，DNA的等电点在4.2 左右；
碱提法、盐提法
在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核 糖核酸沉淀，由此得到RNA的粗制品。
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【原理】
核糖核酸含有核糖、碱基（嘌呤碱、嘧啶碱）和 磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上 述组分的存在。 磷酸+钼酸铵 → 磷钼酸铵↓ 核糖+地衣酚试剂→ 墨绿色化合物 嘌呤碱+硝酸银→ 嘌呤银化物（白色）