酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
废糖液酒精发酵中酵母菌的分离、筛选和验证
废糖液酒精发酵中酵母菌的分离、筛选和验证成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花【期刊名称】《食品与发酵科技》【年(卷),期】2016(052)001【摘要】本研究为了筛选适合废糖液进行酒精发酵的优良酵母菌种,对来自废糖液和苹果皮中天然存在的酵母茵进行富集培养和分离,通过TTC显色法、杜氏管发酵法、二氧化碳失重法三级筛选选出合适的菌株,通过镜检和生长曲线以及发酵七天的还原糖、总酸和酒精度的测定来进一步检验入选菌株的发酵性能.结果表明,富集和分离的185株菌经过三级筛选选出的D7酵母菌发酵性能优良,发酵7d的酒精度达到了11.6％vol,明显高于对照茵的10.4％vol,并且其对数期和稳定期都较长,是废糖液酒精发酵的优良茵株.【总页数】5页(P6-10)【作者】成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花【作者单位】运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1+1【相关文献】1.HPLC法测定玉米浓醪发酵酒精醪液中的纤维二糖和蜜二糖 [J], 张梁;陈蕴;石贵阳;章克昌2.白云边大曲中酵母菌的分离、筛选及发酵条件研究 [J], 王彩丽;曾小涛;查凡;果然;杨亚珍3.一株优良果脯加工废糖液酒精发酵酵母菌生长条件的研究 [J], 成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花4.内蒙古乌海地区沙漠葡萄发酵醪液中酿酒酵母菌的筛选与鉴定 [J], 赵雪平; 温雅娇; 李正英; 郑海武; 黄海英; 李晓娟5.产香酵母菌筛选、条件优化及发酵产物在电子烟烟液中的应用 [J], 巩效伟; 刀娅; 赵伟; 韩熠; 朱东来; 罗义勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定
酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定一、实验目的1.掌握酵母菌的筛选方法2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤3.掌握酵母生产性能的测定：酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、4.学习酒精出酒率的计算二、实验原理酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。
菌落于细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形、椭圆、卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。
酒曲中含有细菌，霉菌，酵母菌等多种菌体，在菌体的分离提取中，通过对原菌的稀释，涂布，多次划线而使各种菌体得以分开，形成单菌落。
通过观察菌落的形态以及在显微镜下对单菌体形态特征的观察确定酵母菌个体。
三、实验材料1．实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电炉，石棉网，水浴锅，移液管，移液管架，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，天平，酒精计，超净工作台，试管，培养皿，接种环，玻璃棒，涂布棒，漏斗，滤纸，玻璃珠，纱布，脱脂棉，酒精灯，白瓷缸，分析天平，量筒，牛皮纸，报纸2．试剂及药品无水乙醇，蒸馏水，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸铵，豆芽，琼脂，蛋白胨，酵母浸膏，硫酸镁，氯化钙。
3．实验材料：酒曲4．种子培养基豆芽汁培养基：黄豆芽 100g；葡萄糖 50g；琼脂 20g；水 1000ml；PH 自然。
5．发酵培养基A 酵母抽提物0.75 g，B 蛋白胨0.75 g，C 硫酸铵0.25 g，D 磷酸二氢钾0.125 g，E 硫酸镁0.09 g，F 氯化钙0.07 g，G 葡萄糖25 g，H 蒸馏水250mL。
四、方法步骤1、产酒酵母菌株的初选（1）实验器材的准备与灭菌1）清洗培养皿、锥形瓶数个，在干燥箱中干燥2）检查并接通高压蒸汽灭菌锅，打开电源，在锅内加水，直至水位显示为高水位，设定温度为121℃，加热时间30min。
3）取出培养皿、锥形瓶，放置降温、用牛皮纸包裹放置在内锅层，加盖，并将盖上的螺栓以两两对称的方式同时旋转拧紧，防止漏气。
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案导读:就爱阅读网友为您分享以下“酵母菌的分离纯化实验方案”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!酵母菌的分离纯化实验目的1. 了解培养基的配置与灭菌技术;2. 无菌操作技术;3. 工业微生物的分离与纯化技术;4. 工业微生物的检测及保藏。
基本原理1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。
也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。
由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。
不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH的要求选择合适的PH。
1由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。
2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。
所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。
3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。
首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。
分离纯化的方法通常有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。
此次实验采用梯度稀释涂布平板法。
4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法(CFU)、光电比浊计数法等。
本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
实验器材仪器设备恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器玻璃器2皿烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片试剂与材料苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液其它纱布、滤纸实验内容及操作步骤(一)、样品的选择酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。
二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。
三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶；试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。
4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。
四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。
2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。
3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4。
5—6.0。
酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化.三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁),葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶;试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上,不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5。
5左右，再分装试管9ml2支/组.4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等.四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗)或土壤5克，加入到100ml无菌水中,充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28—30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊.2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h.3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液,混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
酿酒 分离
酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。
以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。
采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。
2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。
在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。
3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。
4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。
酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。
5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。
这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。
6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。
7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。
在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。
在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。
此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。
在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化（-）菌源1上样用无菌的采样小铲在橘树果园中取上壤表层下1 ~10cm上壤10g,装入火菌的牛皮纸袋内。
封好袋口，记录取样地点、环境及日期。
图样采集后应及时分离，若不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。
2面肥（1）而粉500克，白洒100克，水250,和好静置发酵就可以了。
冬季10个小时。
（2）在温水中兑一点洒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成而肥。
决以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。
3水果果皮桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。
（二）酵母菌的分离1制备菌悬液称取菌源lg，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。
振荡20min,即成10-2的菌源悬液。
再一次稀释成10 \ 10\ 10"三个稀释度。
2涂布法分离取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。
注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果：低于45度培养基易凝固，平板高低不平。
待平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10七10\ IO"三个稀释度菌悬液各0.1ml,依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。
每个稀释度做2~3个平行皿。
左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。
注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。
3培养接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。
4纯化用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
酵母扩培方案一、培养基制备（一）麦芽汁培养基的配制1•培养基成分新鲜麦芽汁一般为10-15波林。
2•配制方法（1）用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h,置于15°C阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。
《酵母菌与酒精发酵》课件
通过芽殖或裂殖的方式进行无性繁殖 ，即母细胞生出一个小突起，逐渐长 大后与母细胞分离，形成新个体。
有性繁殖
在特定条件下，两个性别不同的细胞 结合，形成子囊，每个子囊内产生四 个子囊孢子。
酵母菌的种类与分布
种类
酵母菌种类繁多，根据其用途可分为食品酵母、工业酵母、野生酵母等。
分布
酵母菌在自然界中分布广泛，常见于含糖分较高的偏酸环境中，如水果、蔬菜 表皮和发酵食品中。
研究酵母菌的代谢机制，寻找影响酒精发酵的关键酶和代谢途径，通过调控这些酶 和途径来提高酒精产量。
开发新型的发酵工艺和设备，实现连续发酵和高效分离，以提高酒精产率和生产效 率。
酒精发酵与其他生物技术的结合应用
将酒精发酵与其他生物技术领域 相结合，如生物燃料、生物制药 、生物材料等，拓展酒精发酵的
应用领域。
03
酒精发酵的应用
酿酒业中的应用
酒精发酵是酿酒工业中的核心过程， 通过酵母菌将糖类物质转化为乙醇和 二氧化碳，从而生产出各种类型的酒 品。
酿酒业中，酒精发酵技术不断发展和 创新，提高了酒的品质、口感和风格 ，满足了消费者多样化的需求。
在其他行业中的应用
酒精发酵技术在其他行业中也有广泛应用，如生物能源、食品加工、制药和化工 等领域。
04
酵母菌与酒精发酵的关系
酵母菌在酒精发酵中的作用
酵母菌是酒精发酵的主要微生物，通过将糖类物质转化为乙 醇和二氧化碳，实现酒精发酵过程。
酵母菌具有较高的转化效率和耐受性，能够在高糖浓度和厌 氧条件下生长繁殖，是工业酒精生产的理想菌种。
酵母菌对酒精发酵的影响因素
酵母菌的种类和活性
不同种类的酵母菌具有不同的发酵特 性和耐受性，活性强的酵母菌能够更 好地适应发酵环境，提高酒精产量。
大曲中酵母菌的分离及其鉴定
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ ｉｎ Ｄａｑｕ
ＸＵ Ｊｕｎ， ＬＵＯ Ｈｕｉ－ ｂｏ ， ＣＵＩ Ｄｅ－ ｂａｏ， ＬＩ Ｈａｏ
（ ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，Ｚｉｇｏｎｇ ６４３０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｂｙ Ｄａｑｕ ｙｅａｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｓ ｅｉｇｈｔ ｙｅａｓｔ． Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ ｙｅａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｉｎ ４ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ， Ｃａｎｄｉｄａ， Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｄ Ｄｅｋｋｅｒａ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｄａｑｕ； ｙｅａｓｔ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
菌落生长。
（ ３） 产生类淀粉化合物测定试验［１１］
某些酵母在一定的基质上能生成类淀粉化合物， 遇碘呈
蓝色反应， 故可以作为鉴定某些酵母的指标。将酵母菌菌株接
种 于 蛋 白 胨 酵 母 膏 葡 萄 糖（ ＰＹＤ） 液 体 培 养 基 ， 置 于 ２８℃ 培
养， 生长后加一滴哥氏（ Ｌｕｇｏｌ＇ｓ） 碘液于培养基中摇匀， 如 果 碘
酶实 验 、类 淀 粉 物 质 的 生 成 试 验 阴 性 ， 形 态 学 、生 化 特 性 符 合
酒香酵母属特性。由检索表将其归为酒香酵母属。
Ｍ１ 菌株细胞为芽殖， 细胞为椭圆形。菌株有菌丝形成．子 囊内均有 １～４ 个月牙形的子囊孢子。葡萄糖发酵阳性， 硝酸
实验一 固定化生长酵母发酵酒精
本实验载体的特点
材料 海藻酸钠凝胶 原理 优点 缺点 抗微生物分解能力弱， 机械强度较低（在高浓 度的单价金属离子和磷 酸盐缓冲液的作用下， 凝胶结构会破坏） 海藻酸钠是一种天然高分子多糖， 操作方便，毒 能够于Ca2+螯合形成不溶于水的 性小， 海藻酸钙凝胶。 调节海藻酸钠溶液的浓度可改变 固定化颗粒的机械强度和传质阻 力， 调节CaCl2溶液浓度可改变固定 化颗粒的机械强度。
三、材料和方法
• • • • • • • • （一）材料 1.菌种：酒精酵母（Saccharomyces erevisiae) . Rasses Ⅶ 2.海藻酸钠 3.淀粉水解糖液（10·BX）。 4.其他：注射器、针头、波美计等。 （二）培养基 1.斜面培养基：麦芽汁琼脂斜面 2.酵母细胞培养基 ：葡萄糖 20g,蛋白胨2g，酵母膏2g，硫酸镁0.05g ,自 来水1000毫升，pH5.0。 • 3.固定化酵母增殖培养基：葡萄糖50g, 蔗糖50g, 酵母膏2g, 蛋白胨3g, 硫酸二氢钾1.5g, 氯化铵1.5g, 硫酸镁0.5g, 二氯化锰0.02g, 含水氯化钙 5g, 自来水1000ml, pH5.0. • 4.乙醇发酵培养基：10 ·BX 淀粉水解糖液, 尿素0.2%, 磷酸二氢钾0.01%, pH 5.0.
包埋法载体的选择
• 包埋法较适合于固定化生长态的细胞，细胞可在凝胶网格或微囊中生 长繁殖，细胞大多聚集在载体内表面，提高了细胞密度、减少了传质 阻力。 但由于活细胞生长代谢，载体会受到物理、生物破坏。 • 要求：1、有一定的机械强度； 要求： 2、对酶、微生物、酸碱有耐受力； 3、固定化过程尽量温和，避免酶、细胞损伤； 4、凝胶网格通透性好，其孔径可调节； 5、廉价易得，无毒。 • 常用的载体：天然高聚物——卡拉胶、海藻酸钙、醋酸纤维素酯等； 常用的载体： 合成高聚物——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。
固定化树干毕赤酵母细胞酒精发酵实验
固定化树干毕赤酵母细胞酒精发酵实验一、实验目的掌握海藻酸钙固定化细胞的制备；掌握海藻酸钙固定化酵母细胞的增殖培养；熟悉增殖培养基的配制、灭菌。
用固定化酵母细胞进行酒精发酵，并测定发酵所得的酒精度和产物。
二、实验原理固定化酶（细胞）是将酶或细胞通过物理或化学方法固定在某一载体上或限定在一定空间范围内，而酶（细胞）的活性保持不变，并能反复利用，易与反应液（醪液）分离，催化效率高。
固定化酶（细胞）在固相状态下作用于底物，尤如离子交换树脂，有一定的机械强度，能用装柱或搅拌形式与底物溶液接触。
固定化酶（细胞）与游离酶（细胞）相比具有许多优越性，如酶（细胞）活性保持不变，酶（细胞）致密地分布在载体表面，催化效率高，能反复利用，易与醪液分离，省去了离心设备，简化了工艺。
固定化酶（细胞）技术是目前生物工程的前沿技术，具有广阔的发展空间。
固定化酶的研究始于50年代。
因微生物酶有胞外酶和胞内酶之分。
胞外酶由微生物细胞合成后分泌到培养基中；而胞内酶在整个培养过程中始终保留在细胞内或细胞表面，只有当细胞裂解后才能释放至培养基中。
因此，在使用胞内酶时，应先将其从细胞中提取出来。
有些胞内酶在提取、固定化过程中还会失去活性，提纯过程复杂，故提高了成本，给固定化酶带来许多不便。
另外，有些酶促反应需要多步完成，固定一种酶并不能满足工艺需要。
因此，由固定化酶发展到将整个细胞固定化起来，即微生物细胞固定化，其优点是能避免复杂的酶提取和纯化过程，并解决了酶的不稳定性问题。
细胞固定化后，酶活性高，操作稳定性好，能在多步酶促反应中应用并易于连续化、自动化操作。
固定化细胞的研究要比固定化酶晚10年，但其发展更为迅速，应用也较为广泛。
微生物细胞固定化常用的载体有：（1）多糖类，如纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶、海藻酸钙、K-角叉胶、DEAE-纤维素；（2）蛋白质，如骨胶原，明胶；（3）无机载体，如氧化铝、活性碳、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶；（4）合成载体，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂。
【免费下载】实验一固定化酵母酒精发酵
【免费下载】实验一固定化酵母酒精发酵实验一固定化酵母酒精发酵一、实验目的掌握淀粉质原料的双酶法糖化工艺。
掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。
掌握固定化酵母酒精发酵工艺。
掌握酒精的提取及测定方法。
二、实验原理（一）淀粉质原料的双酶法糖化酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。
酶解法制葡萄糖可分为两步：第1步是利用a —淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。
淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。
淀粉质原料双酶法糖化是一新型生产工艺，免去了原料的高温蒸煮，即可节省蒸煮用汽，又可省去冷却用水、电，同时由于酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高，提高了原料出酒率。
（二）微生物细胞的固定化固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。
它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。
由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应、管路敷设技术通过管线敷设技术，不仅可以解决吊顶层配置不规范问题，而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
酵母菌的培养与分离
微生物学大实验实验指导编者：生物技术教研室2007.3目录实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究实验一酵母菌的培养与分离一、实验目的学习培养和分离酵母菌的技术和方法二、基本原理大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。
三、实验主要内容和要求（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。
2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。
3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。
4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。
四、实验的准备1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。
配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。
酵母菌的分离提取
摘要从烟台葡萄果皮以及干红葡萄酒酿造过程不同阶段发酵液中取样分离得到117株酵母菌株，将分离菌株用WL培养基进行鉴别培养，依据菌落色泽初步归类，然后利用26S rDNA D1/D2区域序列分析，并结合其形态学和生理生化特性对21菌株进行分类鉴定,确定了发酵过程中酵母种类及其菌群变化特点。
用杜氏管发酵试验对117株酵母菌株筛选，挑选其中21株发酵力、香味较好的酵母菌株完成抗性和发酵特性评价。
有5株发酵力强的菌株进行了模拟酒精发酵试验，结果SL8-1发酵产酒精度最高为10.8，SL9-1发酵产酒精度为10.2高于RC212的产酒度9.2，SS9-2产酒精度与商品酵母RC212相同，SS5-1的产酒精度为7.4，SS1-5酵母菌株发酵产酒精度为0，但香气浓郁。
对筛选的5株优良菌株进行26SrDNA D1/D2区分子鉴定，并与模式菌株序列比对分析确认5株酵母SL8-1,SL9-1,SS9-2,SS1-5,SS5-1均为酿酒酵母，此后以商品酵母为对照进行同步RAPD扩增，比较遗传多样性，结果显示这5株酿酒酵母菌株与发酵时接入的商品种子酵母之间多态条带无明显差异。
但两个菌株（SL8-1,SL9-1）的发酵特性，尤其产酒率显著高于商品酵母。
关键词:干红葡萄酒酵母发酵特性评价鉴定ABSTRACT117 natural yeast strains were isolated from Yantai grape fermentation solution of different phase In this paper. Then the strains were classified according to colorful reaction characteristics that showed on the WL medium, and were identified based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and physiological morphologic characterization, in order to study the changes of the yeasts during the period of fermenting.21 strains with high fermentation capacity and strong aroma were selected outfrom 117 strains by Durham tube method. Among them ,5 excellent strains have good fermentation capacity and nice smell. The result of alcohol fermentation showed that alcoholicity of SL8-1yeast strains was10.8, alcoholicity of SL9-1yeast strains was10.2,SS9-2 has same alcoholicity with RC212, alcoholicity of SS5-1yeast strains was7.4, alcoholicity of SS1-5yeast strains was zero ,but it had thick aroma.DNA from the excellent yeast strains then were extracted by micro glass beads and amplified by PCR method. Compare the result sequence with the model strain so as to classify the yeast strains, the result showed that all the 5 strains are saccharomyces.DNA from the excellent yeast strains were analyzed by RAPD-PCR method in order to determine their homology with commercial yeast RC212. We have got that the 5 strains have no difference with the commercial yeast RC212,but the alcoholicity of SL8-1,SL9-1 is better than the commercial yeast.Key Words: Red wine;Yeasts; Fermentative characteristic; Assessment; Identification第一章前言1.1.干红葡萄酒简介葡萄酒是由以整粒或压碎的新鲜葡萄浆果或葡萄汁经酵母发酵而成的低度饮料酒，其成分构成极其复杂，酒中主要成分源自葡萄果粒，如糖分、酒石酸、苹果酸、花色素、单宁、矿物质等，也有部分组分来自发酵过程和陈酿期间，如乙醇、甘油、酯类等。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。
菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。
含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。
1.培养基：1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO42.5g/LNa2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用）★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。
（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养用）（富集用）★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤，10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃20min（分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用）★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/LKH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼脂15g/L PH自然（分离纯化用）★1.5豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。
100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。
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酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
前言酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。
一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。
酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。
此作用即酒精发酵。
C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。
而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。
微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。
包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。
目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。
1.材料与方法1.1 材料1.1.1材料与试剂成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、PVA 、海藻酸钠、CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2培养基乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5 。
YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。
TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水l00 ml。
酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然，去离子水定容至1000 ml。
1.1.3 实验器材酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、烘箱、烧杯、PCR仪，电泳仪、、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片1.2 实验方法1.2.1 酵母菌的分离与培养取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。
用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃烘箱中培养48小时。
富集后用碘液染色后镜检。
然后用接种环在事先灭菌的YPG固体划线并置于28～30 ℃再培养48 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜检。
1.2.2 发酵菌株的筛选向划线分离的YPG培养基上倒入TTC上层培养基，30 ℃下保温(阴暗处)2～3 h。
比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。
选取平板中对应的颜色较深的10株菌，作为二级筛的出发菌株。
选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。
打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。
记录产气及酒精气味情况，并与显色情况进行比较。
1.2.3 发酵菌株的鉴定进行形态学鉴定：A．菌落形态观察，按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。
B. 细胞形态学观察，按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察。
分子生物学鉴定：主要对核糖体小亚基16SrRNA进行PCR扩增鉴定，挑取形态学观察符合酵母特征的菌落作为扩增模版进行PCR，PCR体系(25ul)为：表一 PCR反应体系ddH2O10×PCR buffer（without MgCl2）MgCl2 (25 mM)dNTP(10 mM)5’primer(10 mM)3’primer(10 mM)Template（50 -500 ng/μl）Taq DNA polymerase(5U/μl)34.6 μl5 μl4 μl1 μl2 μl2 μl1 μl0.4 μlTotal 50 μl94℃预变性 5 min94℃变性 30 sec52℃退火 30 sec 40个循环72℃延伸 60 sec72℃延伸 5 min4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）将符合要求的样品，按公司测序订单要求填写。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
1.2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24 h，25 ℃培养30 h。
再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。
固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45 ℃左右。
酵母菌液（预热至35 ℃左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1: 4比例（v/v）混合均匀后，制备固定化细胞。
用注射头直径为2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中预先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。
然后取60粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液中，置25 ℃下发酵4d，测定其酒精含量。
2.结果与分析2.1 发酵菌株初筛结果将葡萄皮中的酵母菌进行富集培养后酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。
不同组材料来源不同，结果显示葡萄皮中的酵母菌数量较多。
故而在酒精发酵中，酵母菌选择的来源非常重要。
在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌，48h后观察菌落。
图一菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
图二为高倍镜下观察到的酵母菌，箭头处明显观察到酵母菌的出芽生殖方式，几乎呈链状。
图三为平板划线后分离单菌落。
图发酵菌株初筛结果2.2 TTC法筛选酵母及酵母产气情况TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，在YPG培养基上覆盖TTC上层培养基培养后出现深红色菌落，说明该菌株产酒精能力较强。
酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。
再进一步挑取红色较深的菌落进行产气检验发现杜氏小关中气体较多，进一步说明所筛选的菌株具有较强的发酵能力，可以进行后续操作。
图四TTC法筛选正面图，图五为TTC法筛选反面，图六产气检验结果。
由第四管看出，CO2仍在不断产生气体，故而在后续操作中用此管中的酵母菌进行操作。
图 TTC法筛选酵母及酵母产气情况表二酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系管号颜色产气量1号粉红++2号红+++3号粉红+4号深红++++2.3 分子生物学鉴定挑取发酵能力较强的菌落进行菌落PCR，电泳结果如图七，条带约为450bp，可以进行测序。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
该序列与编码Irpex lacteus isolate T2b（Han,G., Feng,X. and Tian,X）的18S rRNA基因的部分序列有57%的相似度。
图八和图九为序列比对结果。
(此处仅展示分子生物学鉴定方法)图菌落PCR结果图序列比对结果2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化打开固定化细胞发酵的三角瓶，与未加凝胶珠的瓶子对比，嗅闻有酒香气，上层溶液有浑浊，凝胶珠形状是完好无损。
与其他组实验结果进行比较，从而选出酒精浓度最高一组，进行旋转蒸发获得高浓度酒精。
3.讨论与反思（1）本实验采用平板分离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长时间培养增加了染霉菌的可能性（图三），并且若需得到纯度较高的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。
因此控制霉菌生长很重要，可采取多步平板划线的方式克服此难关。
（2）富集培养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。
死活统计的方法有0.l%美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色。
（3）表一中总结出TTC染色后，菌落颜色深浅和产气量的关系，颜色越深，产气量越多，故在后期酒精发酵时应挑取菌落颜色深的，提高酒精产量。