酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵

吴英玲 10197020 10生物创新班

摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内

4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。

关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵

Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation

ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。

前言

酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸

入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。

C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑

在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1材料与试剂

成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、PVA 、海藻酸钠、CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4•3H2O，

MgSO4•7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等

1.1.2培养基

乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值

4.5 。

YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄

糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。

TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水

l00 ml。

酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，

pH自然，去离子水定容至1000 ml。

1.1.3 实验器材

酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、烘箱、烧杯、PCR仪，电泳仪、、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离与培养

取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃烘箱中培养48小时。富集后用碘液染色后镜检。然后用接种环在事先灭菌的YPG固体划线并置于28～30 ℃再培养48 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜检。

1.2.2 发酵菌株的筛选

向划线分离的YPG培养基上倒入TTC上层培养基，30 ℃下保温(阴暗处)2～3 h。比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。选取平板中对应的颜色较深的10株菌，作为二级筛的出发菌株。

选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。记录产气及酒精气味情况，并与显色情况进行比较。